超極化實(shí)驗(yàn)：

使用SPINLAB極化器進(jìn)行超極化實(shí)驗(yàn)。將100μ[1-13C]（含有15mM的三苯甲基自由基）放入偏振器中。溶液在193.93GHz頻率下被極化三次（2小時(shí)）。將超極化樣品溶解在17.5毫升溶解緩沖液（100毫克/升EDTA）中，并在1.46毫升中和緩沖液（0.4M TRIS，100毫克/升EDTA，0.72M NaOH）中和，得到生理pH值為61.4-68.4毫摩爾的等滲[1-13C]丙酮酸。溶解后的樣品溫度為30-35°C。在4.5毫升呼吸培養(yǎng)基中稀釋0.5毫升[1-13C]丙酮酸，最終濃度約為6毫摩爾[1-13C]丙酮酸。超極化實(shí)驗(yàn)在臺(tái)式1T NMR系統(tǒng)中進(jìn)行，以10°翻轉(zhuǎn)角和2秒重復(fù)時(shí)間進(jìn)行180次采集。使用iNMR軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比率分析，與之前報(bào)道的方法相同。

LDH活性測(cè)定：

LDH活性測(cè)定按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行，僅做少量改動(dòng)。在室溫（RT）下用哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑m-per裂解1×106個(gè)細(xì)胞，并補(bǔ)充蛋白酶抑制劑醇15分鐘，然后離心并收集上清液。在PHERAstar FS微孔板閱讀器中對(duì)384孔板進(jìn)行分析。在吸光度光譜的最高峰（462nm）處讀取吸光度，并根據(jù)LDH樣品溶液中的蛋白質(zhì)量對(duì)活性測(cè)量值進(jìn)行歸一化處理。蛋白質(zhì)定量使用Qubit3.0Flourometer進(jìn)行測(cè)量。

NAD+/NADH定量：

利用酶循環(huán)反應(yīng)測(cè)定法對(duì)細(xì)胞內(nèi)核苷酸、NAD和NADH及其比率進(jìn)行定量。用哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑mper和蛋白酶抑制劑醇和NADH的定量根據(jù)生產(chǎn)商的說明分析在PHERAstar FS微孔板閱讀器的384孔板中進(jìn)行。

RNA純化和定量PCR：

將1×106個(gè)細(xì)胞/毫升接種到6孔板中，在37°C、濕度為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。處理后，使用TRIZOL提取RNA。使用Qubit3.0Flourometer確認(rèn)RNA的濃度和純度。CDNA合成使用Revert Aid First strand cDNA合成試劑盒。根據(jù)制造商的說明使用SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行QPCR。簡言之，以100ngcDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熔解曲線分析確認(rèn)產(chǎn)物的特異性。實(shí)時(shí)qPCR在Agilent Ariamx實(shí)時(shí)系統(tǒng)上進(jìn)行。表1列出了用于qPCR的引物。

統(tǒng)計(jì)分析：

所有數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均在GraphPad Prism5中進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)和雙向或三向重復(fù)測(cè)量方差分析。當(dāng)數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布時(shí)，執(zhí)行對(duì)數(shù)變換。P<0.05（*）的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果：

1.草氨酸對(duì)正常和高血糖NRK-52E培養(yǎng)細(xì)胞活力、增殖和表型的影響

圖1：草氨酸對(duì)正常和高血糖細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞活力、增殖、表型和乳酸生成的影響。A)在高血糖培養(yǎng)條件下（p=0.8933）以及草氨酸處理后（p=0.0002），細(xì)胞活力下降。B)細(xì)胞增殖在高血糖條件下增強(qiáng)（p=0.8429），但在草氨酸處理后受到抑制（p<0.0001）。C)四種細(xì)胞培養(yǎng)物的代表性圖像顯示草氨酸處理后表型的變化。D)在正常和高血糖條件下，NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)物中13C乳酸-Σ信號(hào)的變化與草氨酸處理有關(guān)。高血糖細(xì)胞培養(yǎng)條件增加了信號(hào)（p=0.0005），而草酸鹽處理降低了信號(hào)（p=0.0366）。

為了確定高血糖時(shí)抑制近端腎小管細(xì)胞（PTC）LDH的效果，我們?cè)谡Ｅ囵B(yǎng)條件和高血糖培養(yǎng)條件下培養(yǎng)了NRK-52E細(xì)胞。兩種培養(yǎng)條件均使用LDH抑制劑草氨酸進(jìn)行處理。我們檢測(cè)了細(xì)胞的存活率和增殖率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞暴露在高血糖條件下時(shí)，存活率略有下降，增殖率微弱上升（圖1A和B）。然而，在正常和高血糖的NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)物中加入草氨酸會(huì)顯著降低細(xì)胞活力，分別從90.76%和88.86%降至79.10%和81.64%（p=0.0002），增殖也分別從3.5×106和3.94×106降至2.43×106和2.17×106（p<0.0001）。草氨酸處理對(duì)細(xì)胞形態(tài)也有深遠(yuǎn)影響，因?yàn)樘幚砗蠹?xì)胞體積增大（圖1C）。單獨(dú)暴露于高血糖條件下的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形態(tài)似乎與對(duì)照細(xì)胞相似。單獨(dú)暴露于草氨酸會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)中度空泡化。高血糖條件和草酸鹽處理相結(jié)合，細(xì)胞體積和胞質(zhì)空泡化程度略有增加。

2.草氨酸對(duì)正常和高血糖NRK-52E培養(yǎng)細(xì)胞中LDH、乳酸生成和NAD+/NADH比率的影響

圖2：LDH活性和NAD+/NADH總定量。在高血糖條件下培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中，無論是否經(jīng)草銨膦處理，LDH的檢測(cè)值都較高（p=0.2551）。高血糖條件下（p=0.3181）和草銨膦處理后（p=0.0568），NAD+/NADH比值均下降。

使用超極化[1-13C]丙酮酸，發(fā)現(xiàn)在葡萄糖上培養(yǎng)24小時(shí)的NRK-52E細(xì)胞的乳酸信號(hào)比正常對(duì)照細(xì)胞增加了3倍（p=0.0005）（圖1D）。用草酸鹽處理正常和高血糖細(xì)胞培養(yǎng)物表明，用草酸鹽處理減少了兩組細(xì)胞中丙酮酸到乳酸的產(chǎn)生（p=0.037）（圖1D）。與正常細(xì)胞相比，高血糖條件下NRK-52E細(xì)胞的LDH活性在數(shù)值上更高，盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.0572），同樣，草氨酸處理后LDH活性在數(shù)值上更低（p=0.098）（圖2A）。正常細(xì)胞和高血糖細(xì)胞的NAD+/NADH比值基本相似（p=0.3181），而在草氨酸處理后觀察到NAD+/NADH比值降低（p=0.0568）（圖2B）。