研究簡介:動物進(jìn)化出對不同時間尺度的氧氣變化產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)反應(yīng)。雖然調(diào)控長期低氧反應(yīng)（hypoxia）的缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）轉(zhuǎn)錄通路已被確立1，但哺乳動物急性缺氧反應(yīng)的調(diào)控通路仍不清楚。研究首次揭示嗅覺受體Olfr78在小鼠頸動脈體（carotid body，CB）的急性低氧感知中扮演關(guān)鍵角色。作者通過RNA-seq與微陣列篩查發(fā)現(xiàn)，Olfr78在CB的I型球細(xì)胞（glomus cells）中高度選擇性表達(dá)，而在功能相似卻不急性響應(yīng)低氧的腎上腺髓質(zhì)中幾乎不表達(dá)。Olfr78-/-突變鼠在10%O?刺激下呼吸頻率和分鐘通氣量不增加，但對5%CO?的高碳酸反應(yīng)正常，證明缺陷特異于低氧通路。本研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺受體Olfr78在頸動脈體的氧敏感球細(xì)胞（glomus cells）中高度特異性表達(dá)。頸動脈體是位于頸動脈分叉處的化學(xué)感受器官，可在血氧下降時數(shù)秒內(nèi)觸發(fā)呼吸增強。電生理記錄顯示，Olfr78缺失顯著削弱缺氧誘導(dǎo)的竇神經(jīng)放電，而細(xì)胞數(shù)量與超微結(jié)構(gòu)保持完好。體外實驗進(jìn)一步表明，缺氧或氰化物抑制線粒體后迅速升高的乳酸（lactate）可劑量依賴性激活Olfr78（EC??≈4 mM），并誘發(fā)球細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變；在Olfr78-/-組織，該反應(yīng)消失。研究人員提出機(jī)體缺氧→線粒體受抑→乳酸堆積→乳酸作為“代謝信使”結(jié)合Olfr78→球細(xì)胞去極化→竇神經(jīng)放電→腦干呼吸中樞驅(qū)動通氣。該模型把傳統(tǒng)“直接氧感受”修正為“代謝狀態(tài)感受”，為急性缺氧通氣調(diào)控提供新分子框架，并提示Olfr78可能成為調(diào)控呼吸的潛在藥靶。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

unisense微電極用于實時監(jiān)測灌流槽內(nèi)ACSF或生理緩沖液的PO?，以精確控制缺氧刺激的起始與強度。將傳感器校準(zhǔn)于實驗溫度（33–34℃或室溫），插入記錄槽，連續(xù)讀出電壓信號；在從95%O?/5%CO?切換至95%N?/5%CO?過程中，PO?從625 mmHg降至60 mmHg的時間曲線被用于關(guān)聯(lián)竇神經(jīng)放電變化。unisense微電極被精確量化灌流液PO2動態(tài)變化（從基線625 mmHg降至60 mmHg），為神經(jīng)放電實驗提供標(biāo)準(zhǔn)化缺氧刺激，驗證超氧條件（95%O2/5%CO2）下乳酸刺激的特異性，排除低氧干擾。通過高時空分辨率氧監(jiān)測，確保實驗條件可控性，為機(jī)制研究提供關(guān)鍵環(huán)境參數(shù)驗證。

實驗結(jié)論

嗅覺受體Olfr78在頸動脈體的氧敏感球細(xì)胞（glomus cells）中高度特異性表達(dá)。頸動脈體是位于頸動脈分叉處的化學(xué)感受器官，可在血氧下降時數(shù)秒內(nèi)觸發(fā)呼吸增強關(guān)鍵詞：電纜細(xì)菌，電生硫化物氧化，硫酸鹽還原，淡水沉積物，隱秘硫循環(huán)。Olfr78突變體在缺氧時無法增加通氣量，但對高碳酸血癥（hypercapnia）反應(yīng)正常。突變體的球細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)完整，但缺氧誘導(dǎo)的頸動脈體活性降低。乳酸（hypoxia中快速積累的代謝物，可誘導(dǎo)過度通氣3-6）在異源表達(dá)實驗中激活Olfr78，觸發(fā)球細(xì)胞鈣瞬變，并通過Olfr78刺激頸動脈竇神經(jīng)活性。除嗅覺功能外，Olfr78通過感知缺氧時產(chǎn)生的乳酸，在呼吸調(diào)控回路中充當(dāng)缺氧傳感器。

圖1、Olfr78在頸動脈體球細(xì)胞中的表達(dá)。a.通過RNA測序比較成年小鼠頸動脈體（CB）與腎上腺髓質(zhì)（AM）中26，728個基因的表達(dá)水平。以每10^7條比對reads的對數(shù)（log2）表示。b.在CB和/或AM中高表達(dá)的嗅覺受體（OR）基因；X表示CB相對于AM的富集倍數(shù)。c–f.Olfr78敲入報告小鼠（Olfr78-GFPtaulacZ）的X-gal染色（藍(lán)色，β-半乳糖苷酶活性）。c.腎上腺，未見報告基因表達(dá)。d.頸動脈分叉背面觀，可見CB（虛線圈）及偶見血管（箭頭）e，f.頸動脈分叉橫切面及局部放大。g，h.CB切片免疫染色：Olfr78報告基因（GFP，綠色）與球細(xì)胞標(biāo)志物酪氨酸羥化酶（TH，紅色）共定位；不與內(nèi)皮標(biāo)志物CD31（紅色）共定位。DAPI染核（藍(lán)色）。i–k.頸動脈分叉腹面觀X-gal染色：i.CB（虛線圈）由竇神經(jīng)（實心箭頭）支配，后者為舌咽神經(jīng)（空心箭頭）分支。j.異位“微球體”（MG）同樣受舌咽神經(jīng)支配。k.巖神經(jīng)節(jié)（箭頭）、結(jié)狀/頸靜脈神經(jīng)節(jié)（箭頭）均無報告基因表達(dá)。l.Olfr78報告基因在CB發(fā)育過程中的表達(dá)時間軸：實心圓＝強表達(dá)；空心圓＝未檢出。

圖2、Olfr78缺失小鼠對缺氧及高碳酸的通氣反應(yīng)。通過全身體積描記法測定清醒、自由活動Olfr78+/+與Olfr78-/-同窩鼠的呼吸頻率（RR）、潮氣量（TV）及分鐘通氣量（MV=RR×TV）。a，b.缺氧（10%O?）刺激下的RR（a）及缺氧反應(yīng)百分比變化（b）。c，d.高碳酸（5%CO?）刺激下的RR（c）及高碳酸反應(yīng)百分比變化（d）

圖3、Olfr78介導(dǎo)頸動脈體氧感受。a，b.Olfr78+/+與Olfr78-/-CB切片：GFP（綠）、TH（紅）、DAPI（藍(lán)）。突變體結(jié)構(gòu)正常。c.CB中TH陽性細(xì)胞計數(shù)。d–g.透射電鏡：野生型與突變型球細(xì)胞均含大核（*）、大致密芯囊泡（空箭頭）及小清芯突觸囊泡（實箭頭）。h，i.以竇神經(jīng)放電頻率評估CB對缺氧（h）及低pH（i）的反應(yīng)?；揖€示灌流液PO?時間曲線

圖4、乳酸激活Olfr78并刺激頸動脈體感覺活動。a.在HEK293T中利用雙報告基因檢測乳酸對Olfr78的激活（空載體灰線，Olfr78黑線）。b.麻醉小鼠缺氧3 min后的動脈血乳酸水平。c，d.GCaMP3標(biāo)記球細(xì)胞在缺氧、乳酸（30 mM）、氰化物（2 mM）刺激下的鈣反應(yīng)。e.野生型與Olfr78-/-CB對30 mM乳酸的竇神經(jīng)放電反應(yīng)。f.氧感受模型：缺氧→線粒體受抑→乳酸↑→結(jié)合Olfr78→球細(xì)胞Ca2?↑→呼吸驅(qū)動。

圖5、暴露于低氧和高二氧化碳環(huán)境下的Olfr78?/?突變體的潮氣量和分鐘通氣量。未束縛、未麻醉的Olfr78+/+對照組和Olfr78?/?突變體同窩仔鼠的全身體積描記。a、b）暴露于低氧環(huán)境下的動物的潮氣量（TV）和分鐘通氣量（MV）。n=9（+/+），8（?/?）只動物。c、d）暴露于高二氧化碳環(huán)境下的動物的潮氣量和分鐘通氣量。n=4（+/+），5（?/?）只動物。

結(jié)論與展望

本研究是斯坦福大學(xué)團(tuán)隊最新研究成果發(fā)表在《Nature》上，本研究揭示了嗅覺受體Olfr78在頸動脈體氧感知中的關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為頸動脈體通過直接檢測血氧變化調(diào)節(jié)呼吸，但具體機(jī)制存在爭議。團(tuán)隊通過RNA測序發(fā)現(xiàn)嗅覺受體Olfr78在頸動脈體（92倍于腎上腺髓質(zhì)）高表達(dá)，且特異性定位在氧敏感的球細(xì)胞（glomus cells）中?；蚯贸龑嶒烇@示，Olfr78缺失小鼠在缺氧條件下無法增加通氣量，但對高碳酸血癥反應(yīng)正常，表明其特異性參與低氧反應(yīng)。電生理記錄進(jìn)一步證實，突變體的頸動脈竇神經(jīng)在缺氧時放電活動顯著減弱。本研究提出創(chuàng)新機(jī)制：缺氧時乳酸快速積累（3-6 mM），通過激活Olfr78（EC50=4.0 mM）觸發(fā)球細(xì)胞鈣瞬變和神經(jīng)信號傳導(dǎo)。這一發(fā)現(xiàn)將代謝產(chǎn)物（乳酸）與氧感知直接關(guān)聯(lián)，解釋了為何線粒體抑制劑（如氰化物）能模擬缺氧效應(yīng)。團(tuán)隊還驗證了乳酸在體外（HEK293T細(xì)胞）和體內(nèi)（頸動脈體切片）均能激活Olfr78通路，而敲除小鼠對該刺激無反應(yīng)。該研究不僅揭示了急性缺氧反應(yīng)的分子機(jī)制，還拓展了嗅覺受體在非嗅覺生理功能中的新角色。unisense微電極在本研究中應(yīng)用于實時監(jiān)測灌流槽內(nèi)ACSF或生理緩沖液的PO?，以精確控制缺氧刺激的起始與強度。unisesne微電極系統(tǒng)通過高時空分辨率氧監(jiān)測，確保實驗條件可控性，為機(jī)制研究提供關(guān)鍵環(huán)境參數(shù)驗證。