我們?cè)诹虬匪刂委?4小時(shí)后進(jìn)行了HSPC移植(每個(gè)受者約105個(gè)系-cKit+Sca1+(LKS)細(xì)胞)，并在18-24小時(shí)后測(cè)量了每個(gè)進(jìn)入鈣基底膜的LKS細(xì)胞周圍的pO2。我們得到的pO2值幾乎涵蓋了化療后(升高的)BM pO2的整個(gè)范圍(圖3c)，這表明HSPC并沒有尋找由低pO2定義的特定壁龕作為優(yōu)先歸巢的位置。

這些觀察結(jié)果促使我們重新研究血液流動(dòng)在BM中的情況。具體來說，我們想知道，在nestin+與nestin-血管中觀察到的pO2差異，以及在穩(wěn)定狀態(tài)與放療/化療動(dòng)物中觀察到的pO2差異，是否至少可以部分地通過血流曲線來解釋。我們注射了CFSE標(biāo)記的紅細(xì)胞(RBC)，并將成像速度提高到每秒120幀(掃描1/4幀)，以便跟蹤單個(gè)RBC的流動(dòng)方向和速度。有趣的是，在nestin+血管中觀察到的紅細(xì)胞流速最高(>2毫米/秒，而在正弦血管中為0.2-1毫米/秒)。血管網(wǎng)絡(luò)圖顯示，nestin+血管總是位于竇狀血管的上游，并向竇狀血管排水(圖4a)，這表明nestin+血管具有動(dòng)脈特征。熒光抗Sca-1抗體的體內(nèi)免疫染色證實(shí)它們是動(dòng)脈(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7a)。

使用標(biāo)記的紅細(xì)胞進(jìn)行血流成像還有助于克服放療/化療后染料泄漏的問題，并使我們能夠通過分析視頻序列中流動(dòng)紅細(xì)胞的軌跡來劃分功能性血管。我們發(fā)現(xiàn)，在致命性照射后2-6天(擴(kuò)展資料圖7b和擴(kuò)展資料視頻1)，紅細(xì)胞的流動(dòng)出奇地旺盛，而此時(shí)紅細(xì)胞的細(xì)胞活力正急劇下降(擴(kuò)展資料圖8)。充足的血液供應(yīng)和減少的氧消耗(減少的骨髓細(xì)胞活力)可以解釋放療和化療后pO2升高的原因。細(xì)胞減少也可以解釋為什么骨髓抑制調(diào)理后血管內(nèi)和血管外pO2梯度消失。

為了進(jìn)一步確定細(xì)胞活力與耗氧量之間的聯(lián)系，我們將來自GFP供體小鼠的25×106個(gè)總骨髓細(xì)胞輸注到接受致死性照射的DsRed受體中(圖4b)。我們?cè)诘?天和第5天通過FACS驗(yàn)證了大部分增殖(Ki-67+)細(xì)胞都在供體部分(圖4c)。然后，通過體內(nèi)成像，我們發(fā)現(xiàn)骨髓中包含供體(GFP+)和受體(DsRed+)細(xì)胞的異質(zhì)斑塊，局部pO2存在相應(yīng)差異(圖4b)。較低的pO2與大群綠色細(xì)胞有關(guān)，這與增殖細(xì)胞更熱衷于消耗氧氣的觀點(diǎn)一致(圖4d)。

總之，直接測(cè)量血液中的絕對(duì)pO2揭示了一個(gè)獨(dú)特的缺氧景觀，即血管密集(供氧)和細(xì)胞密集(耗氧)。供氧和耗氧之間的平衡會(huì)因放療和化療等壓力而改變。局部地形是由基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)不同類型血管的定位進(jìn)一步確定的(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9)。特別是，靠近nestin+動(dòng)脈的造血干細(xì)胞和靠近竇狀血管的造血干細(xì)胞將經(jīng)歷不同的代謝環(huán)境，這凸顯了進(jìn)一步研究不同血管龕在造血干細(xì)胞調(diào)控中的作用的必要性。

方法

雙光子pO2顯微鏡

顯微鏡由兩個(gè)激發(fā)臂組成：一個(gè)視頻速率激光掃描雙光子成像臂和一個(gè)點(diǎn)檢測(cè)雙光子磷光壽命傳感臂(擴(kuò)展資料圖1)。調(diào)諧到840或913nm的80MHz飛秒激光源的輸出通過偏振分束器(PBS1)分為s偏振和p偏振。s偏振光束穿過PBS1進(jìn)入成像臂，而p偏振光束則偏轉(zhuǎn)90°進(jìn)入點(diǎn)檢測(cè)臂。每個(gè)臂的功率可通過旋轉(zhuǎn)PBS1前面的半波板進(jìn)行調(diào)節(jié)。這些偏振光束隨后在進(jìn)入物鏡前由第二個(gè)偏振分光鏡(PBS2)重新組合。

在點(diǎn)檢測(cè)臂上，光束利用振鏡掃描儀(6220H)掃過狹縫孔徑(NT38-560)，然后成像到樣品上，形成一條~3.5μm的掃描線。這種一維掃描同時(shí)達(dá)到兩個(gè)目的。首先，它產(chǎn)生了一個(gè)脈沖持續(xù)時(shí)間可調(diào)(15-40微秒)的激發(fā)門，由狹縫孔徑上的掃描速度決定。其次，它可以減少可能伴隨靜態(tài)激發(fā)的三重態(tài)飽和效應(yīng)，從而有助于防止軸向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的退化。使用激發(fā)門后，使用定制的光子計(jì)數(shù)電路記錄單個(gè)磷光光子的到達(dá)時(shí)間。然后分析光子到達(dá)時(shí)間的直方圖，以獲得三重態(tài)的壽命。我們發(fā)現(xiàn)pO2測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差通常低于4mmHg，并且與信噪比(SNR，數(shù)據(jù)未顯示)成反比。

對(duì)于成像臂，我們使用了與之前描述的類似的掃描引擎，并使用PBS2將光束與點(diǎn)檢測(cè)臂結(jié)合在一起。然后，光束由工作距離為280μm的60×1.2 NA水浸式無窮遠(yuǎn)校正近紅外鍍膜物鏡聚焦。

PtP-C343的描述和校準(zhǔn)

PtP-C343中的雙光子天線香豆素343(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)在840納米波長(zhǎng)處的雙光子吸收截面(σ2)約為28GM，熒光量子產(chǎn)率φfl)約為0.90。這意味著PtPC343的雙光子作用截面(η=σ2φfl)約為25.2GM。C343和PtP的FRET效率(?FRET)約為0.68。在無氧條件下，PtP-C343的磷光壽命(τ0)約為60μs，其動(dòng)態(tài)范圍非常適合pO2的生理范圍。為了進(jìn)行校準(zhǔn)，我們?cè)隗w外38℃、pH值為7.4的PtP-C343緩沖溶液中記錄了由氧電極(OX-500，UnisenseA/S，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2)獨(dú)立記錄的pO2范圍內(nèi)的壽命測(cè)量值。我們的結(jié)果與已公布的同一批染料的曲線相吻合(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2)。

動(dòng)物制備

所有程序均已獲得麻省總醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)。所有體內(nèi)PtPC343實(shí)驗(yàn)均使用年齡小于6個(gè)月的雄性野生型C57BL/6J(杰克遜實(shí)驗(yàn)室)和C57BL/6 Nes-GFP小鼠。在典型實(shí)驗(yàn)中，通過吸入1.35%-2%異氟醚和氧氣的混合物緩慢誘導(dǎo)小鼠麻醉。為維持麻醉狀態(tài)，將混合氣體降至1.25%異氟醚和98.75%氧氣。該方案最大程度地減少了麻醉對(duì)組織pO2的影響。通過頭皮上的U形切口暴露髑髏骨，以創(chuàng)建皮瓣，并在頭皮上放置2%的甲基纖維素凝膠以進(jìn)行折射率匹配。

然后，給小鼠靜脈注射100-180μl懸浮于0.9%磷酸鹽緩沖鹽水中的1.7mM PtP-C343，以及40-60μl 10mg/ml 70kDa RhodamineB-Dextran。我們使用了相對(duì)較多的PtP-C343，以便在血管外達(dá)到足夠的濃度，進(jìn)行間質(zhì)pO2測(cè)量。如前所述，將小鼠置于加熱平臺(tái)上，頭骨置于物鏡下方。每次成像時(shí)掃描小鼠顱骨約4×6mm的區(qū)域，包括左右額骨內(nèi)大部分矢狀旁BM腔，并選擇適當(dāng)位置進(jìn)行pO2測(cè)量。與之前的體內(nèi)研究一致，使用PtP-C343探頭沒有觀察到明顯的毒性或光毒性。成像結(jié)束后，用6-0線縫合頭皮，讓小鼠蘇醒。在最終實(shí)驗(yàn)中，小鼠會(huì)因脊髓脫落或二氧化碳安樂死而死亡。

在分析血管大小與骨內(nèi)膜表面距離的函數(shù)關(guān)系時(shí)，我們注意到，距離骨表面20-40μm和>40μm的血管普遍比0-20μm區(qū)域大，平均直徑分別為27.0μm和26.9μm(p分別<0.002和0.06，圖2a)。距離骨表面大于40μm的區(qū)域構(gòu)成了密集的正弦血管網(wǎng)絡(luò)，與靠近骨表面的血管相比，其形狀更不規(guī)則(圖2a)。