摘要

有效霉素A(Val-A)是鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在控制水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病方面具有廣泛的農(nóng)業(yè)應用價值。本研究探討了堿性pH沖擊對增強Val-A產(chǎn)量的影響及其機制。通過一次或多次NaOH沖擊處理，結合更快的蛋白質(zhì)合成和糖消耗，實現(xiàn)了更高的Val-A產(chǎn)量；堿性pH沖擊可使Val-A產(chǎn)量提高27.43%。與氨基酸代謝、碳代謝和電子呼吸鏈相關的基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，同時伴隨著呼吸活性和谷氨酸濃度的大幅增加。Val-A的產(chǎn)量受到一系列復雜機制的促進，并響應pH脅迫信號，這導致了谷氨酸代謝和呼吸活性的增強。所獲得的信息將有助于未來抗生素產(chǎn)量提高的研究以及分子機制的深入揭示。

1.引言

抗真菌抗生素有效霉素A(Val-A)由工業(yè)菌株吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)發(fā)酵產(chǎn)生，在東亞已被廣泛用作控制水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病的首要藥劑。提高Val-A產(chǎn)量的研究備受關注，但似乎對提高生產(chǎn)效率作用有限。pH是微生物代謝的綜合反映，從而影響發(fā)酵過程和細胞生長。pH可以影響代謝方向，不同階段生長和產(chǎn)物合成的最適pH也不同。相同的微生物在不同的環(huán)境pH條件下可能產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。例如，在pH 2-3條件下，黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵蔗糖的主要產(chǎn)物是檸檬酸，但當pH變?yōu)?時，主要產(chǎn)物是草酸(Lu et al.,2016)。因此，在發(fā)酵過程中，采用適當?shù)牟呗钥刂苝H可以獲得所需的產(chǎn)品。

發(fā)酵pH對鏈霉菌的發(fā)酵也有很大影響，其中一些鏈霉菌具有特定的響應措施。不同抗生素的合成需要不同的pH，即使是同一種抗生素，在不同的培養(yǎng)階段也需要不同的pH才能獲得最高產(chǎn)量。根據(jù)Chan的研究(Chan et al.,2015)，提出了一種兩階段pH控制策略，即在培養(yǎng)112小時后將培養(yǎng)pH從5.5調(diào)整到5.8，以提高恩拉霉素（enduracidin）的產(chǎn)量，生產(chǎn)效率提高了51.2%。再例如，通過基于原位pH監(jiān)測的種子階段優(yōu)化，ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。

環(huán)境脅迫一直是促進鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的關鍵方法，環(huán)境信號可以通過啟動復雜的轉(zhuǎn)導系統(tǒng)來提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(Li et al.,2016)。鏈霉菌基于不同類型的環(huán)境因素，具有許多獨特的信號轉(zhuǎn)導機制。在天藍色鏈霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2))中，pH沖擊誘導了放線紫紅素（actinorhodin）生產(chǎn)的調(diào)控基因和生物合成基因的過表達(Kim et al.,2007,2008)。此外，在鏈霉菌sp.CK4412(Streptomyces sp.CK4412)中，推定的酸沖擊誘導基因SCO7832的表達通過途徑特異性調(diào)控基因的過表達刺激了tautomycetin的生產(chǎn)(Park et al.,2009)。此外，雙組分調(diào)控系統(tǒng)也是一種非常重要的調(diào)控方式。據(jù)報道，雙組分系統(tǒng)DraR/DraK參與了天藍色鏈霉菌中抗生素生物合成的調(diào)控(Yeo et al.,2013)。在白色鏈霉菌M-Z18(Streptomyces albulus M-Z18)中，研究了高ε-聚-L-賴氨酸生產(chǎn)對酸性pH的生理響應，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脅迫響應蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、細胞壁和細胞膜、次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、DNA和RNA代謝以及核糖體亞基相關的基因在酸性pH響應中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而，關于pH沖擊對Val-A產(chǎn)量和生物合成途徑中基因表達影響的信息很少，而這些信息對于改進抗生素發(fā)酵和降低成本具有重要價值。直到最近，我們首次采用堿性pH沖擊來增強Val-A的產(chǎn)量，并且初步確定pH沖擊的適宜pH約為8.0(Zhou et al.,2016)。

本研究旨在探討pH沖擊對Val-A發(fā)酵過程的影響，并揭示pH與Val-A產(chǎn)量之間的關系。基于吸水鏈霉菌5008在不同pH沖擊條件下合成Val-A的產(chǎn)量變化規(guī)律以及最新的基因組研究進展，研究了pH對基因表達的影響及其在生理水平上的規(guī)律，以探索pH沖擊提高Val-A產(chǎn)量的機制。首先，選擇pH作為環(huán)境脅迫，從代謝活性分析角度提高Val-A產(chǎn)量，并構建了結合pH沖擊的高效發(fā)酵策略。此外，依次探討了pH沖擊對基因表達和細胞微環(huán)境的影響。最后，全面討論了pH沖擊對Val-A生產(chǎn)的機制。據(jù)我們所知，這是在Val-A發(fā)酵中采用環(huán)境脅迫的首次嘗試。它也可為其他放線菌生產(chǎn)抗生素提供良好的參考。

2.材料與方法

2.1.微生物與發(fā)酵條件

所用菌株吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)(CGMCC 4.1026)是工業(yè)上Val-A的生產(chǎn)菌株，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

孢子形成瓊脂培養(yǎng)基包含：豆粕20 g/L，麥芽糖20 g/L，瓊脂20 g/L。培養(yǎng)基用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.0，并于121°C高壓滅菌20分鐘。在37°C培養(yǎng)八天后收集孢子，懸浮于20%(v/v)甘油中，并于-80°C保存?zhèn)溆谩?

種子培養(yǎng)基組成：玉米粉30 g/L，豆粕22 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 0.8 g/L。接種50μL孢子懸浮液(1.5 x 10?cfu/mL)后，在250mL搖瓶（含50 mL種子培養(yǎng)基）中，于37°C，220 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上進行預培養(yǎng)。

對于Val-A生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基包含：玉米粉100g/L，豆粕25g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1.5g/L。將5mL種子培養(yǎng)物接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在37°C和220 rpm下發(fā)酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。

2.2.提高Val-A產(chǎn)量的pH沖擊策略

2.2.1.不同堿液進行pH沖擊

當發(fā)酵進行24小時時，分別向不同處理組的發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水，將發(fā)酵液的pH從自然pH 6.4調(diào)整到pH 8.0。

2.2.2.不同時間點進行pH沖擊

六個不同處理組的發(fā)酵分別進行4 h、8h、12h、16h、20h和24h，然后向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

2.2.3.不同處理次數(shù)

三組設置如下：

一次pH沖擊處理：當發(fā)酵進行20 h時，向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0。

兩次pH沖擊處理：當發(fā)酵進行20 h和44 h時，向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0。

三次pH沖擊處理：當發(fā)酵進行20 h、44 h和68h時，向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0。

2.3.細胞重量、殘余碳源和Val-A產(chǎn)量的分析

每天取2mL發(fā)酵液樣品用于分析細胞重量、殘余碳源和Val-A產(chǎn)量。樣品在12,000g下離心5分鐘。取0.5mL上清液用等體積氯仿萃取，然后用0.22-μm親水性濾膜過濾。含有Val-A的過濾樣品采用高效液相色譜法(HPLC)分析(Iwasa et al.,1971)。由于種子培養(yǎng)基中的玉米粉和豆粕不溶，標準的干重法不可行，因此使用標準的Bradford法測量細胞內(nèi)蛋白質(zhì)以反映細胞生長(Kieser et al.,2000)。培養(yǎng)基中的總殘?zhí)亲鳛樘荚赐ㄟ^標準的苯酚-硫酸法測定(Liao et al.,2009)。