In Situ Monitoring of the Antibacterial Activity of a Copper-Silver Alloy Using Confocal Laser Scanning Microscopy and pH Microsensors

使用共聚焦激光掃描顯微鏡和pH微傳感器原位監測銅銀合金的抗菌活性

來源：Global Challenges, Volume 3, 2019, Article ID 1900044

《全球挑戰》第3卷，2019年，文章編號1900044

 

摘要

這篇論文摘要闡述了研究團隊成功證明了銅銀合金涂層在模擬干燥表面生物膜形成條件下的抗菌效力，按照美國EPA測試方法，在24小時內對測試菌種的減少率≥99.9%。研究設計了一種定制的共聚焦成像方案，用于原位觀察銅銀合金表面細菌生物膜的殺滅過程并監測其100分鐘內的動力學。銅銀合金涂層在5分鐘內即可根除革蘭氏陽性菌生物膜，而對革蘭氏陰性菌生物膜的殺滅速度較慢。原位pH監測表明，在金屬表面與細菌生物膜界面處pH值升高了2個對數單位；然而，在緩沖液中測試時，細菌的存活率并未直接受到此pH升高（pH 8.0-9.5）的影響。因此，在環境條件下，電化學活性表面與細菌生物膜相互作用導致的OH-生成，是銅銀合金涂層接觸介導殺滅的一個方面，而非觀察到的抗菌效力的直接原因。細菌細胞的氧化、銅離子的釋放以及局部pH升高的結合，共同表征了銅銀合金涂層干燥表面的抗菌活性。

 

研究目的

本研究旨在評估銅銀合金涂層在更接近真實使用條件（即干燥條件，允許細菌生物膜形成）下的抗菌活性，并探究其作用機制。具體目的是利用美國EPA測試方法驗證其有效性，通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）原位觀察殺菌動力學，并使用pH微傳感器監測界面處的局部pH變化，以闡明pH升高在接觸殺滅過程中的作用。

 

研究思路

研究思路首先按照美國EPA的兩種測試方案（Protocol 1: 作為消毒劑的效力；Protocol 2: 持續減少細菌污染）驗證銅銀合金涂層對多種細菌（包括金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、產氣腸桿菌、銅綠假單胞菌）的抗菌效力。然后，設計了一種改良的活/死細胞染色方案，結合共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），直接在銅銀合金涂層表面及未涂層的不銹鋼（AISI 316）對照表面原位、實時（100分鐘內）觀察金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜被殺滅的動態過程。同時，使用丹麥Unisense的pH微電極，精確測量并監測細菌懸液層與涂層表面界面處的局部pH變化。此外，通過將金黃色葡萄球菌暴露于不同pH（8.0-9.5）的緩沖液中，評估pH單獨對細菌存活的影響，以區分pH升高在殺菌機制中的直接作用。

 

測量的數據及研究意義

1. 抗菌效力數據：通過菌落形成單位計數，計算銅銀合金涂層在不同時間點（2, 6, 12, 18, 24小時）對測試菌種的減少百分比。數據顯示，涂層對所有測試菌種在24小時內均達到≥99.9%的減少率（表1）。研究意義在于嚴格按照國際標準（US EPA）驗證了該銅銀合金涂層在模擬真實干燥污染場景下的高效、廣譜抗菌性能，為其在醫療環境等實際應用提供了可靠的數據支持。

 

2. 原位殺菌動力學數據：通過CLSM圖像和生物量定量分析，顯示金黃色葡萄球菌在接觸銅銀合金涂層5分鐘內活菌數量顯著下降，60分鐘內大部分細胞死亡；而銅綠假單胞菌的殺滅速度較慢，活死細胞比例在60分鐘后才發生顯著轉變（圖1, 圖2, 圖3）。研究意義在于直觀、實時地揭示了涂層對不同類型細菌（革蘭氏陽性 vs. 革蘭氏陰性）的殺滅速率存在差異，提示細胞壁結構等因素可能影響其抗菌效果，并為優化涂層應用提供了時間動力學依據。

 

 

 

3. 界面pH變化數據：使用Unisense pH微電極測量發現，在金黃色葡萄球菌懸液與銅銀合金涂層界面處，pH以約0.14單位/分鐘的速率上升，20分鐘內達到pH 9.0以上平臺期；而在無細菌存在時，pH先快速升至9.5后因氧化亞銅形成而緩慢下降；不銹鋼對照表面pH則保持穩定或略有下降（圖4, 圖5）。研究意義在于直接證實了涂層表面的電化學活性導致界面局部產生OH-，引起pH顯著升高，明確了這一現象是涂層與細菌相互作用的結果。

 

 

4. pH單獨作用評估數據：將金黃色葡萄球菌暴露于pH 8.0-9.5的Tris-HCl緩沖液中1小時和24小時，其存活率僅略有下降（約1個對數單位），遠低于涂層接觸殺滅的效果（4-5個對數單位）（表2）。研究意義在于排除了所觀察到的pH升高范圍（8.0-9.5）是導致細菌大量死亡的主要原因，表明涂層的抗菌活性是多種因素協同作用的結果，而非單純由堿性環境引起。

 

結論

1. 銅銀合金涂層在模擬干燥表面生物膜形成的條件下，表現出強大的抗菌效力，符合美國EPA標準，能在24小時內持續減少多種細菌污染≥99.9%。

2. 原位CLSM監測揭示了涂層對金黃色葡萄球菌生物膜的殺滅速度快于銅綠假單胞菌，表明細菌類型影響抗菌動力學。

3. 涂層與細菌生物膜相互作用會引發電化學活性，導致界面局部pH顯著升高（至9.0以上），但這種pH升高本身并非觀察到的強力殺菌作用的主要直接原因。

4. 銅銀合金涂層的抗菌活性是細菌細胞氧化、銅離子釋放以及局部pH升高共同作用的結果，這種電化學驅動的多重機制確保了其在預期環境應用中的有效性。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

使用丹麥Unisense pH微電極（型號PH25，尖端直徑約25μm）測量的數據在本研究中具有關鍵的研究意義。首先，該電極的高空間分辨率使其能夠精確放置在距離金屬表面不到100微米的位置，直接測量涂層與細菌生物膜界面處這一微小區域的實時pH變化，這是常規pH電極無法實現的。其快速響應時間（90%響應<10秒）成功捕捉到了pH的快速動態變化，例如在無細菌存在時，涂層界面pH在4分鐘內從約7.0迅速升至9.5以上，以及有細菌存在時pH以0.14單位/分鐘速率上升至平臺期。這些高精度、實時的數據直接證實了銅銀合金涂層作為一種電化學活性表面，在與含電解質的環境（如細菌懸液或瓊脂糖基質）接觸時，會發生還原反應（O? + 2H?O + 4e? → 4OH?），導致界面處OH-離子積累和pH升高。這不僅為理解涂層的抗菌機制提供了關鍵的物理化學證據，還將觀察到的現象（殺菌）與潛在的機制（電化學反應引起的局部環境改變）聯系起來。通過對比有/無細菌存在時的pH變化曲線，Unisense電極的數據還幫助揭示了細菌生物膜的存在影響了反應的平衡狀態（減緩了pH上升速率并形成平臺），暗示生物質參與了電化學過程。此外，結合緩沖液實驗，電極測量的pH數據幫助排除了所測pH范圍（8.0-9.5）是殺菌主要直接原因的可能性，從而更準確地界定pH升高在復雜抗菌機制中的角色（協同因素而非主導因素）。總之，Unisense微電極的應用使得研究能夠超越宏觀觀察，深入到微觀界面過程，為闡明銅銀合金涂層基于電化學原理的抗菌機制提供了不可或缺的定量和動態信息。