Low yield and abiotic origin of N2O formed by the complete nitrifier Nitrospira inopinata

由完全硝化劑 Nitrospira inopinata 形成的 N2O 的低產(chǎn)和非生物來源

來源：Nature Communications（2019年，第10卷）

 

論文總結(jié)

研究通過綜合運(yùn)用微生物生理學(xué)、基因組學(xué)和同位素技術(shù)，探究了完全氨氧化細(xì)菌（comammox）Nitrospira inopinata 產(chǎn)生一氧化氮（NO）和氧化亞氮（N2O）的能力、途徑及產(chǎn)量，并與傳統(tǒng)氨氧化細(xì)菌（AOB）和古菌（AOA）進(jìn)行了比較。以下是對論文的詳細(xì)總結(jié)。

摘要概括

摘要指出，N2O是一種重要的溫室氣體，微生物硝化作用是其主要來源之一。傳統(tǒng)認(rèn)為氨氧化細(xì)菌（AOB）和古菌（AOA）是N2O的主要生產(chǎn)者，但新發(fā)現(xiàn)的完全氨氧化細(xì)菌（comammox）的貢獻(xiàn)未知。本研究以純培養(yǎng)的comammox細(xì)菌N. inopinata為對象，發(fā)現(xiàn)其對NO清除劑敏感、不能反硝化產(chǎn)生N2O，且N2O產(chǎn)量與AOA相當(dāng)?shù)h(yuǎn)低于AOB。進(jìn)一步證明其N2O源于羥胺（NH2OH）的非生物轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)量不受氧氣濃度影響。基因組分析表明comammox缺乏NO還原酶（nor基因），無法進(jìn)行硝化菌反硝化。結(jié)果表明comammox在硝化過程中可能比AOB產(chǎn)生更少的N2O，對全球N2O排放的貢獻(xiàn)較小。

研究目的

本研究旨在解決以下核心問題：

 

評估comammox細(xì)菌N. inopinata產(chǎn)生NO和N2O的能力及產(chǎn)量。

闡明其NO和N2O產(chǎn)生的途徑（生物 vs. 非生物）。

通過比較基因組學(xué)分析comammox的氮代謝基因庫存，揭示其與AOB/AOA的差異。

 

量化不同氧氣條件下N2O的產(chǎn)量，評估環(huán)境因素對其排放的影響。

 

研究思路

研究采用多學(xué)科方法：

 

比較基因組學(xué)：分析N. inopinata及23個(gè)comammox宏基因組組裝基因組（MAGs）的氮代謝關(guān)鍵基因（如nirK、nor、cytL等），與AOB/AOA對比（Fig. 2）。

 

微呼吸測量：使用丹麥Unisense微電極系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測O2、NO和N2O的瞬時(shí)動(dòng)力學(xué)，探究NH3和NO2?氧化過程中的氣體產(chǎn)生與消耗（Fig. 3, 4, 5）。

 

 

 

抑制劑實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用NO清除劑PTIO抑制N. inopinata活性，驗(yàn)證NO在代謝中的關(guān)鍵作用。

批量培養(yǎng)與氣體測量：通過氣相色譜（GC）定量N2O產(chǎn)量，計(jì)算N2O/NH3比值，評估缺氧與富氧條件下的差異（Fig. 6）。

 

同位素分析：測定N2O的位點(diǎn)偏好（δ15N-SP），區(qū)分生物與非生物來源。

 

非生物控制實(shí)驗(yàn)：驗(yàn)證熱死細(xì)胞及培養(yǎng)基組分對N2O產(chǎn)生的貢獻(xiàn)。

 

測量數(shù)據(jù)及其研究意義

以下列出關(guān)鍵測量數(shù)據(jù)、其來源（圖編號）及研究意義：

 

基因組庫存數(shù)據(jù)（來源：Fig. 2）

 

數(shù)據(jù)：所有comammox基因組（包括N. inopinata）均編碼nirK（亞硝酸鹽還原酶），但完全缺乏norCBQD和norSY（NO還原酶）基因；cytL（P460細(xì)胞色素）基因零星分布。

 

研究意義：遺傳證據(jù)表明comammox無法通過硝化菌反硝化途徑還原NO至N2O，與AOB形成鮮明對比；nirK存在提示其可能產(chǎn)生NO。

 

微呼吸動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（來源：Fig. 3, 4）

 

數(shù)據(jù)：NH3氧化時(shí)，NO快速升至峰值（~13 nM）后消耗；NO2?氧化時(shí)，NO穩(wěn)定在~45 nM；缺氧時(shí)無NO釋放。O2消耗與NO產(chǎn)生耦合。

 

研究意義：證明NO是代謝中間體，但產(chǎn)生量低（較AOB低10倍）；缺氧無NO表明無厭氧呼吸能力；支持NO可能通過未知NO氧化酶（NOO）再氧化。

 

PTIO抑制數(shù)據(jù)（來源：Supplementary Fig. 5）

 

數(shù)據(jù)：PTIO對N. inopinata的EC50為18.9 μM（微呼吸）和63.6 μM（批量培養(yǎng)），接近AOA（17.5-18.3 μM）但遠(yuǎn)低于AOB（>300 μM）；抑制可逆（低濃度時(shí)）。

 

研究意義：NO清除抑制活性，證實(shí)NO是代謝關(guān)鍵中間體；comammox對PTIO敏感性與AOA相似，提示調(diào)控機(jī)制類似。

 

N2O產(chǎn)量與同位素?cái)?shù)據(jù)（來源：Fig. 5, 6）

 

數(shù)據(jù)：富氧下N2O產(chǎn)量為0.070±0.006%（N2O/NH3）；缺氧下為0.073±0.033%，無顯著差異；δ15N-SP為33.4±0.3‰（富氧）和34.2±1.4‰（缺氧），與NH2OH非生物轉(zhuǎn)化一致（30.8-35.6‰）。

 

研究意義：N2O產(chǎn)量低且與AOA相當(dāng)（0.07-0.09%）；產(chǎn)量不隨氧氣變化，與AOB相反（缺氧時(shí)增高）；同位素證據(jù)支持非生物起源（NH2OH與NO2?反應(yīng)）。

 

非生物控制數(shù)據(jù)（方法部分）

 

數(shù)據(jù)：熱死細(xì)胞+NH2OH/NO2?產(chǎn)生0.83±0.1 μM N2O，與活細(xì)胞延遲釋放的N2O量吻合。

 

研究意義：直接證明N2O源于胞外NH2OH的化學(xué)分解，而非酶促反應(yīng)；排除生物反硝化貢獻(xiàn)。

 

研究結(jié)論

本研究得出以下核心結(jié)論：

 

Comammox的N2O產(chǎn)量低：N. inopinata的N2O產(chǎn)量（0.07%）與AOA相當(dāng)，遠(yuǎn)低于AOB（0.095-0.27%），表明其在環(huán)境中可能不是主要N2O源。

非生物起源主導(dǎo)：N2O主要來自NH2OH與NO2?的化學(xué)反應(yīng)，而非酶促反硝化；同位素簽名（高δ15N-SP）和缺氧無增量支持此機(jī)制。

遺傳缺陷致無反硝化能力：comammox缺乏nor基因，無法進(jìn)行硝化菌反硝化，與AOB根本不同。

NO為關(guān)鍵中間體但嚴(yán)格調(diào)控：NO由HAO或NirK產(chǎn)生，但產(chǎn)量低且缺氧不積累，提示存在高效NO氧化或消耗途徑。

 

生態(tài)意義：Comammox在低氮環(huán)境中可能降低N2O排放，但需野外研究驗(yàn)證；PTIO不能選擇性抑制AOA（comammox同樣敏感）。

 

丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

在本研究中，丹麥Unisense微電極系統(tǒng)（型號OX-MR、N2O-MR和ami700-NO）用于實(shí)時(shí)監(jiān)測微生物呼吸和氣體動(dòng)力學(xué)，其研究意義主要體現(xiàn)在：

 

高分辨率實(shí)時(shí)監(jiān)測：Unisense電極提供nM級檢測限（NO檢測限0.25 nM），允許在毫升級反應(yīng)室中連續(xù)追蹤O2、NO和N2O的瞬時(shí)變化（如Fig. 3-5）。例如，F(xiàn)ig. 3顯示NO峰值在O2消耗30%時(shí)出現(xiàn)，直接證明NO產(chǎn)生與好氧氨氧化耦合。

揭示代謝動(dòng)態(tài)：電極數(shù)據(jù)捕捉到NO產(chǎn)生與消耗的快速轉(zhuǎn)換（如Fig. 3中NO峰后下降），提示N. inopinata存在NO氧化機(jī)制；而缺氧無NO釋放（對比AOB）證明其無厭氧反硝化能力。

定量動(dòng)力學(xué)參數(shù)：通過測量底物添加后的氣體通量，計(jì)算表觀速率（如O2消耗率）、親和力（Km）和閾值，為模型提供參數(shù)（如Fig. 4中NO2?氧化時(shí)NO穩(wěn)態(tài)~45 nM）。

驗(yàn)證遺傳假設(shè)：電極數(shù)據(jù)與基因組結(jié)果一致——無nor基因?qū)е聼oN2O積累（Fig. 5中N2O傳感器無信號）；PTIO抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)NO的代謝中心角色。

技術(shù)優(yōu)勢：Unisense系統(tǒng)的微尺度測量（10 mL反應(yīng)室）避免頭空間干擾，提供原位溶解氣體濃度；多傳感器同步監(jiān)測（O2、NO、N2O）確保數(shù)據(jù)一致性。

 

生態(tài)推論：低NO產(chǎn)量（nM級）和N2O缺乏表明comammox在自然環(huán)境中可能不貢獻(xiàn)顯著N2O，電極數(shù)據(jù)為降低排放的策略提供依據(jù)。

 

總之，丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)是本研究的實(shí)驗(yàn)核心，通過提供高精度、實(shí)時(shí)的氣體動(dòng)力學(xué)測量，它直接驗(yàn)證了comammox的代謝特性（低NO產(chǎn)量、無N2O酶促產(chǎn)生）、揭示了非生物N2O起源，并支撐了其與AOB/AOA的功能差異。這項(xiàng)技術(shù)突出了微呼吸測量在微生物生理學(xué)研究中的關(guān)鍵作用，為理解氮循環(huán)微生物的排放貢獻(xiàn)提供了可靠方法。