Differential toxicity of anatase and rutile TiO2 nanoparticles to the antioxidant enzyme system and metabolic activities of freshwater biofilms based on microelectrodes and fluorescence in situ hybridization

基于微電極和熒光原位雜交的銳鈦礦和金紅石TiO2納米粒子對(duì)淡水生物膜的抗氧化酶系統(tǒng)和代謝活性的差異毒性

來(lái)源：《Environmental Science: Nano》（2019年）

 

論文總結(jié)

研究通過(guò)綜合實(shí)驗(yàn)方法，比較了anatase（An-NPs）和rutile（Ru-NPs）TiO2納米顆粒對(duì)淡水生物膜的毒性差異，重點(diǎn)評(píng)估了抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)、代謝活動(dòng)及微生物空間分布。以下是對(duì)論文的詳細(xì)總結(jié)。

 

摘要概括

摘要指出，TiO2納米顆粒（TiO2-NPs）廣泛用于工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用，但其不同晶型（anatase和rutile）對(duì)淡水生物膜的毒性差異尚不明確。本研究將淡水生物膜暴露于10 mg L?1的An-NPs和Ru-NPs中，發(fā)現(xiàn)An-NPs易聚集并沉積在生物膜表面（高達(dá)78%），導(dǎo)致上層細(xì)胞（約1 mm）發(fā)生壞死樣死亡（NLD），主要源于光氧化產(chǎn)生的無(wú)細(xì)胞ROS和顯著的乳酸脫氫酶（LDH）釋放。Ru-NPs則更容易滲透生物膜，誘導(dǎo)凋亡樣死亡（ALD），由細(xì)胞內(nèi)ROS驅(qū)動(dòng)。光與TiO2-NPs協(xié)同作用下，抗氧化酶系統(tǒng)能快速響應(yīng)ROS，但24小時(shí)后防御鏈不完全。整合生物標(biāo)志物響應(yīng)（IBR）表明，An-NPs引起急性中毒，而Ru-NPs毒性隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。氧代謝僅在生物膜上層（~480 μm）被抑制，但氨氧化顯著減少，與NP類型無(wú)關(guān)， due to對(duì)氨氧化微生物（AOMs）的抑制。總體，TiO2-NPs的毒性與其初始特性和水環(huán)境行為密切相關(guān)。

 

研究目的

本研究旨在：

 

揭示不同晶型TiO2-NPs（An-NPs和Ru-NPs）對(duì)淡水生物膜的毒性機(jī)制差異，包括細(xì)胞死亡模式、ROS產(chǎn)生和抗氧化響應(yīng)。

評(píng)估抗氧化酶系統(tǒng)（如CAT、SOD、GR、GSH-Px）作為生物標(biāo)志物的敏感性，并使用IBR指數(shù)綜合評(píng)估毒性壓力。

利用微電極技術(shù)原位測(cè)量生物膜內(nèi)部的O?和NH??濃度剖面，量化代謝活動(dòng)（氧呼吸和氨氧化）的抑制效應(yīng)。

通過(guò)熒光原位雜交（FISH）分析異養(yǎng)細(xì)菌和氨氧化微生物（AOB和AOA）的空間分布變化， linking毒性效應(yīng)與微生物功能。

 

為光敏納米材料在淡水環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，強(qiáng)調(diào)晶型特性和環(huán)境行為的重要性。

 

研究思路

研究采用多維度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

 

生物膜培養(yǎng)與暴露：從太湖采集淡水，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)菌和古菌生物膜（厚度~6000 μm），暴露于10 mg L?1 An-NPs或Ru-NPs中24小時(shí)，模擬急性污染場(chǎng)景。

NP行為表征：通過(guò)沉降實(shí)驗(yàn)、Zeta電位和ICP-MS分析NP的膠體穩(wěn)定性、聚集沉降及在生物膜中的分布（Ti濃度測(cè)量）。

毒性指標(biāo)測(cè)量：使用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）評(píng)估細(xì)胞死亡模式（NLD vs. ALD）；測(cè)量ROS產(chǎn)生、LDH釋放和EPS分泌。

抗氧化酶活性分析：測(cè)定CAT、SOD、GR和GSH-Px活性隨時(shí)間變化（0-24小時(shí)），并計(jì)算IBR指數(shù)以綜合評(píng)估毒性。

微電極測(cè)量：使用丹麥Unisense微電極系統(tǒng)（O?和NH??微電極）原位測(cè)量生物膜內(nèi)部的濃度剖面，計(jì)算凈比代謝率（R(O?)和R(NH??)）和抑制率。

微生物群落分析：通過(guò)FISH技術(shù) with 16S rRNA探針，可視化異養(yǎng)細(xì)菌、AOB和AOA的空間分布。

 

數(shù)據(jù)整合：結(jié)合所有數(shù)據(jù)，比較An-NPs和Ru-NPs的毒性機(jī)制和生態(tài)影響。

 

測(cè)量數(shù)據(jù)及其研究意義

以下列出關(guān)鍵測(cè)量數(shù)據(jù)、其來(lái)源（圖/表編號(hào)）及研究意義：

 

NP膠體行為和分布數(shù)據(jù)（來(lái)源：Fig. 1）

 

數(shù)據(jù)：沉降曲線（Fig. 1A）顯示An-NPs在12小時(shí)內(nèi)快速沉降，而Ru-NPs沉降較慢；Ti分布（Fig. 1B）顯示An-NPs主要沉積在生物膜表面（<1 mm，75.2 mg kg?1），Ru-NPs能滲透更深（56.4 mg kg?1）。

 

研究意義：An-NPs易聚集沉積，導(dǎo)致表面毒性；Ru-NPs更穩(wěn)定且能滲透內(nèi)部，引起深層毒性。這解釋了毒性機(jī)制的空間差異。

 

細(xì)胞死亡模式和ROS數(shù)據(jù)（來(lái)源：Fig. 2）

 

數(shù)據(jù)：FCM和CLSM顯示Ru-NPs誘導(dǎo)更多ALD（凋亡樣死亡），An-NPs誘導(dǎo)更多NLD（壞死樣死亡）；ROS產(chǎn)生（Fig. 2C）在Ru-NPs組更高（206% of control），LDH釋放（Fig. 2C）在An-NPs組更顯著；EPS分泌（Fig. 2D）在Ru-NPs組增加更多。

 

研究意義：An-NPs通過(guò)光氧化產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞ROS，導(dǎo)致表面細(xì)胞壞死；Ru-NPs通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS誘導(dǎo)凋亡，并觸發(fā)EPS分泌作為防御機(jī)制。這揭示了晶型依賴的毒性路徑。

 

抗氧化酶活性數(shù)據(jù)（來(lái)源：Fig. 3）

 

數(shù)據(jù)：CAT、SOD、GR和GSH-Px活性在暴露后6-18小時(shí)增加，峰值在18小時(shí)（如SOD達(dá)56.5 U mg?1 prot for An-NPs），24小時(shí)時(shí)下降但仍高于對(duì)照。

 

研究意義：抗氧化酶快速響應(yīng)ROS壓力，但24小時(shí)時(shí)防御不完全，表明氧化損傷累積。An-NPs引起更早的酶活性峰值，符合急性毒性特征。

 

IBR指數(shù)數(shù)據(jù)（來(lái)源：Fig. 4E）

 

數(shù)據(jù)：IBR值顯示An-NPs在暴露初期（6-18小時(shí)）IBR更高，表明急性中毒；Ru-NPs的IBR隨時(shí)間逐漸增加，表明持續(xù)性毒性。

 

研究意義：IBR綜合了多種酶活性，有效評(píng)估生物膜健康狀態(tài)。An-NPs的急性效應(yīng)與光氧化相關(guān)，Ru-NPs的漸進(jìn)毒性與滲透和細(xì)胞內(nèi)ROS相關(guān)。

 

微電極代謝數(shù)據(jù)（來(lái)源：Fig. 5）

 

數(shù)據(jù)：O?濃度剖面（Fig. 5A）顯示TiO2-NPs抑制上層生物膜（~480 μm）的氧呼吸；R(O?)計(jì)算（Fig. 5B）表明An-NPs抑制更表面（最大代謝率0.603 mg L?1 cm?3 h?1），Ru-NPs抑制更深層。NH??濃度剖面（Fig. 5C）和R(NH??)（Fig. 5D）顯示氨氧化被顯著抑制（抑制率59.1% for An-NPs, 78.6% for Ru-NPs）。

 

研究意義：微電極提供高分辨率代謝數(shù)據(jù)，顯示TiO2-NPs普遍抑制氨氧化，但氧抑制僅限于上層。Ru-NPs對(duì)氨氧化的抑制更強(qiáng)， due to更深滲透。

 

FISH微生物分布數(shù)據(jù)（來(lái)源：Fig. 6）

 

數(shù)據(jù)：FISH圖像顯示An-NPs減少表面AOMs（AOB和AOA）豐度，Ru-NPs導(dǎo)致更均勻的減少；AOB在An-NPs組主導(dǎo)氨氧化，AOA在Ru-NPs組貢獻(xiàn)增加。

 

研究意義：毒性改變了微生物群落空間結(jié)構(gòu)，An-NPs影響表面微生物，Ru-NPs影響整體分布，與代謝數(shù)據(jù)一致。

 

研究結(jié)論

本研究得出以下核心結(jié)論：

 

毒性機(jī)制差異：An-NPs通過(guò)光氧化產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞ROS，導(dǎo)致表面細(xì)胞NLD和急性毒性；Ru-NPs通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS誘導(dǎo)ALD和漸進(jìn)毒性，并能滲透生物膜深層。

抗氧化響應(yīng)：抗氧化酶系統(tǒng)（CAT、SOD、GR、GSH-Px）能快速響應(yīng)ROS，但防御鏈在24小時(shí)不完全，IBR有效區(qū)分急性與漸進(jìn)毒性。

代謝抑制：氧呼吸僅在生物膜上層（~480 μm）被抑制，且An-NPs抑制表面，Ru-NPs抑制更深；氨氧化普遍被抑制，Ru-NPs抑制更強(qiáng)（78.6%）。

微生物影響：AOMs豐度減少，An-NPs更影響表面AOB，Ru-NPs均勻減少AOA和AOB，改變?nèi)郝涔δ堋?

 

環(huán)境意義：TiO2-NPs的毒性取決于晶型特性（光活性、穩(wěn)定性）和環(huán)境行為（聚集、滲透），在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中需考慮晶型和光照條件。

 

丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

在本研究中，丹麥Unisense微電極系統(tǒng)（型號(hào)PA2000）用于測(cè)量生物膜內(nèi)部的O?和NH??濃度剖面，其研究意義主要體現(xiàn)在：

 

原位高分辨率測(cè)量：Unisense微電極具有微小尖端（~10 μm），能插入生物膜內(nèi)部而不顯著擾動(dòng)結(jié)構(gòu)，提供實(shí)時(shí)的O?和NH??濃度數(shù)據(jù)（空間分辨率達(dá)μm級(jí)）。這允許精確繪制濃度梯度，如Fig. 5所示，直接揭示代謝活動(dòng)的空間異質(zhì)性。

量化代謝抑制：通過(guò)濃度剖面計(jì)算凈比代謝率（R(O?)和R(NH??)），如R(O?)從0.711 mg L?1 cm?3 h?1（對(duì)照）降至0.603（An-NPs）和0.333（Ru-NPs），準(zhǔn)確量化了TiO2-NPs對(duì)氧呼吸和氨氧化的抑制程度。抑制率計(jì)算（42.9% for An-NPs, 49.3% for Ru-NPs）提供了毒性效應(yīng)的數(shù)值指標(biāo)。

揭示毒性深度差異：數(shù)據(jù)顯示An-NPs主要抑制生物膜上層（<480 μm）的代謝，而Ru-NPs能抑制更深層（>600 μm），這與NP分布數(shù)據(jù)（Fig. 1B）一致。這解釋了An-NPs的表面毒性和Ru-NPs的滲透毒性機(jī)制。

支持機(jī)制驗(yàn)證：微電極數(shù)據(jù)與FISH結(jié)果（Fig. 6）互補(bǔ)，顯示代謝抑制與AOMs分布變化相關(guān)。例如，氨氧化抑制與AOB/AOA減少吻合，驗(yàn)證了功能微生物的毒性響應(yīng)。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)可靠性：Unisense系統(tǒng)的高精度和校準(zhǔn)能力（如O?電極用N?/空氣校準(zhǔn)）確保了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，避免了取樣誤差。實(shí)時(shí)測(cè)量捕獲了動(dòng)態(tài)變化，為急性暴露研究提供可靠時(shí)間序列數(shù)據(jù)。

 

環(huán)境應(yīng)用意義：微電極技術(shù)適用于復(fù)雜生物膜系統(tǒng)，能模擬真實(shí)環(huán)境條件（如自然光照），為納米材料生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了原位監(jiān)測(cè)工具。本研究凸顯了Unisense數(shù)據(jù)在 linking NP行為與生物效應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

 

總之，丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)是本研究的核心，通過(guò)提供原位代謝測(cè)量，直接證明了TiO2-NPs對(duì)生物膜功能的抑制，并揭示了晶型依賴的毒性深度差異，為理解納米材料生態(tài)毒性機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)證據(jù)。