Developmental stages and gut microenvironments influence gut microbiota dynamics in the invasive beetle Popillia japonica Newman (Coleoptera: Scarabaeidae)

發(fā)育階段和腸道微環(huán)境影響入侵甲蟲 Popillia japonica Newman（鞘翅目：Scarabaeidae）的腸道微生物群動力學(xué)

來源：Environmental Microbiology (2019) 21(11), 4343–4359

 

摘要概括

本研究系統(tǒng)性地探究了入侵性甲蟲日本金龜子（Popillia japonica）在其整個生命周期（幼蟲、蛹、成蟲）和不同腸道區(qū)域（前腸、中腸、后腸）中，其腸道微生物群的起源、穩(wěn)定性和更替。研究結(jié)果表明，土壤微生物是幼蟲腸道細(xì)菌的一個重要來源。然而，隨著昆蟲的發(fā)育，其腸道微生物群的豐富度和多樣性顯著下降（例如，從幼蟲到成蟲，OTU數(shù)量從~336降至~99），群落組成也發(fā)生巨大變化。 Notably，只有16.75% 的幼蟲期土壤細(xì)菌能持續(xù)存留到成蟲階段。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不同腸道區(qū)域的微環(huán)境（如pH、氧氣可用性、氧化還原電位）是塑造微生物群落組成的關(guān)鍵因素。此外，日本金龜子在所有發(fā)育階段都保有一個穩(wěn)定的核心細(xì)菌群落，主要由已知能降解植物材料的類群組成，包括Ruminococcacae、Christensenellaceae和Lachnospiraceae家族。有趣的是，Christensenellaceae此前僅在人類腸道中發(fā)現(xiàn)，但本研究發(fā)現(xiàn)日本金龜子攜帶的該類群屬于該家族中不同的分類進(jìn)化枝。這些發(fā)現(xiàn)揭示了宿主發(fā)育、腸道微環(huán)境與微生物群落組裝之間復(fù)雜的相互作用。

研究目的

本研究旨在深入探究以下三個核心問題：

 

起源與穩(wěn)定性：日本金龜子的腸道菌群是穩(wěn)定遺傳的“核心 microbiota”，還是在每個發(fā)育階段從周圍環(huán)境（幼蟲棲息的根際土壤 vs. 成蟲活動的空中環(huán)境）選擇性招募的？

發(fā)育動態(tài)：腸道菌群是否在胚胎后發(fā)育階段（幼蟲、蛹、成蟲）之間穩(wěn)定維持，還是會因昆蟲發(fā)育（如變態(tài)）而發(fā)生重大的菌群更替？

 

微環(huán)境影響：腸道內(nèi)不同的微環(huán)境（不同區(qū)段） 是否影響并塑造了微生物群落的結(jié)構(gòu)？

 

研究思路

研究團(tuán)隊(duì)遵循了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹皹颖静杉?高通量測序-物化測量-多維度分析”思路：

 

樣本采集與分組：從意大利入侵種群中采集日本金龜子的不同發(fā)育階段（L1, L2, L3幼蟲，蛹，雄/雌成蟲）以及其棲息地的土壤樣本。將每個發(fā)育階段的腸道解剖為前腸、中腸、后腸三個區(qū)段進(jìn)行研究。

微生物群落解析：對所有樣本進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子測序，獲得微生物的組成和多樣性數(shù)據(jù)。通過生物信息學(xué)分析（如Alpha/Beta多樣性分析、隨機(jī)森林分類、指示物種分析）比較不同發(fā)育階段和不同腸道區(qū)段的微生物群落差異。

環(huán)境因子測量：使用丹麥Unisense微電極原位測量幼蟲和成蟲各腸道區(qū)段的pH、氧氣濃度（pO?）和氧化還原電位，以量化其微環(huán)境差異。

關(guān)聯(lián)性分析：將獲得的微生物群落數(shù)據(jù)與測得的物理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)分析（如NMDS擬合分析），以揭示微環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造作用。

 

核心菌群鑒定：通過比較分析，鑒定出在所有發(fā)育階段中穩(wěn)定存在的核心微生物類群，并探討其潛在功能。

 

測量數(shù)據(jù)及其研究意義

 

微生物群落Alpha多樣性數(shù)據(jù)（豐富度與多樣性）

 

數(shù)據(jù)來源：正文中的Table 1 和 Supporting Information Fig. S2 展示了各樣本的Chao1（豐富度）、Shannon（多樣性）和Pielou（均勻度）指數(shù)。

 

研究意義：數(shù)據(jù)顯示，土壤的微生物豐富度和多樣性最高。在昆蟲體內(nèi)，幼蟲期的微生物多樣性最高，而成蟲期最低。這表明在發(fā)育過程中，昆蟲腸道對微生物進(jìn)行了強(qiáng)烈的選擇性篩選，蛹期是一個關(guān)鍵的瓶頸階段。

 

微生物群落Beta多樣性數(shù)據(jù)（群落結(jié)構(gòu)差異）

 

數(shù)據(jù)來源：圖2A 的NMDS分析圖展示了不同樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。

 

研究意義：圖2A 清晰顯示，土壤樣本與所有昆蟲樣本明顯分離。在昆蟲樣本中，幼蟲和成蟲的菌群結(jié)構(gòu)顯著不同，而蛹的菌群則散布在兩者之間，再次證明蛹期是菌群重組的過渡階段。此外，同一昆蟲的不同腸道區(qū)段也形成了獨(dú)立的簇，表明腸道位置對菌群結(jié)構(gòu)有重大影響。

 

微生物群落組成數(shù)據(jù)（門、綱、科水平）

 

數(shù)據(jù)來源：圖3 的柱狀圖展示了在不同發(fā)育階段（B）和不同腸道區(qū)段（C）的優(yōu)勢菌門和菌科的相對豐度。

 

研究意義：圖3B 顯示，從幼蟲到成蟲，放線菌門（Actinobacteria）的豐度下降，而擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度上升。圖3C 表明，從土壤到昆蟲后腸，厚壁菌門（Firmicutes）的豐度顯著增加。這揭示了微生物群落隨宿主發(fā)育和腸道環(huán)境的動態(tài)演替規(guī)律。

 

腸道物理化學(xué)環(huán)境數(shù)據(jù)（pH, pO?, Redox）

 

數(shù)據(jù)來源：Supporting Information Fig. S5 和 圖2B 的向量展示了使用Unisense微電極測得的幼蟲和成蟲各腸段的pH、氧氣濃度和氧化還原電位值。

 

研究意義：這些原位測量數(shù)據(jù)是連接“結(jié)構(gòu)”與“功能”的橋梁。測量發(fā)現(xiàn)成蟲中腸氧氣濃度波動較大，而后腸則嚴(yán)格厭氧；幼蟲中后腸呈堿性。圖2B 的NMDS擬合分析進(jìn)一步表明，幼蟲菌群結(jié)構(gòu)與pH顯著相關(guān)（R2=0.75），而成蟲菌群結(jié)構(gòu)與氧氣濃度（R2=0.54）和氧化還原電位（R2=0.74）顯著相關(guān)。這直接證明了不同的腸道微環(huán)境是驅(qū)動微生物群落空間分異的關(guān)鍵物理化學(xué) force。

 

核心與特征微生物類群數(shù)據(jù)

 

數(shù)據(jù)來源：圖1B 的維恩圖展示了不同發(fā)育階段與土壤共享的OTU數(shù)量；圖4 的TEA分析展示了在昆蟲腸道中顯著富集的細(xì)菌家族。

 

研究意義：圖1B 表明昆蟲與土壤共享的OTU很少，證明腸道菌群是高度選擇性的。圖4 的TEA分析發(fā)現(xiàn)，Ruminococcacae、Christensenellaceae和Lachnospiraceae 等家族在昆蟲腸道中顯著富集，而這些菌在土壤中幾乎不存在。這些菌是已知的纖維素降解菌，它們的富集表明其可能在幫助宿主消化植物材料方面扮演著關(guān)鍵共生角色，構(gòu)成了日本金龜子的核心功能菌群。

 

研究結(jié)論

本研究得出以下核心結(jié)論：

 

日本金龜子的腸道微生物群是動態(tài)變化的。土壤是幼蟲菌群的重要來源，但宿主發(fā)育階段和腸道區(qū)段是比土壤來源更強(qiáng)大的菌群塑造力。

蛹期是菌群更替的關(guān)鍵瓶頸，導(dǎo)致幼蟲的大量菌群丟失，成蟲菌群需要重新組裝或從少量保留的核心菌群發(fā)展而來。

腸道內(nèi)不同的物理化學(xué)微環(huán)境（pH, O?, Redox） 是導(dǎo)致微生物群落空間分布差異的主要驅(qū)動因素。

 

盡管菌群動態(tài)變化，日本金龜子仍保有一個穩(wěn)定的核心菌群（如Ruminococcacae, Christensenellaceae, Lachnospiraceae），這些菌群可能通過提供降解植物纖維素的功能，在宿主的入侵成功和適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。

 

丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

在本研究中，使用丹麥Unisense微電極原位測量的pH、氧氣濃度（pO?）和氧化還原電位數(shù)據(jù)（Supporting Information Fig. S5 和 圖2B）具有至關(guān)重要的作用，其研究意義主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

 

提供了腸道微環(huán)境的直接、原位定量證據(jù)：傳統(tǒng)方法需要將腸道內(nèi)容物擠出測量，這會改變其真實(shí)的化學(xué)狀態(tài)。Unisense微電極的尖端極其微?。?0μm），可以精確插入完整的腸道組織中進(jìn)行實(shí)時測量，獲取了最接近生理狀態(tài)的真實(shí)數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)首次定量揭示了日本金龜子不同腸段是一個高度異質(zhì)性的化學(xué)梯度系統(tǒng)（如成蟲前腸可能微需氧，而后腸嚴(yán)格厭氧），為解釋微生物的空間分布提供了最直接的環(huán)境背景。

將微生物生態(tài)分布與具體的環(huán)境驅(qū)動因子直接鏈接：本研究沒有停留在觀察到“菌群不同”的現(xiàn)象上，而是通過Unisense電極測得了“為何不同”的原因。通過圖2B 的NMDS擬合分析，研究將菌群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與物理化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，幼蟲腸道的高pH值是其菌群結(jié)構(gòu)的主要塑造者，而成蟲腸道菌群則主要受氧氣水平和氧化還原電位的控制。這種定量化的關(guān)聯(lián)性分析極大地增強(qiáng)了結(jié)論的說服力，從“相關(guān)”推進(jìn)到了“機(jī)理”闡釋的層面。

其高空間分辨率揭示了傳統(tǒng)方法無法獲取的微米級梯度信息：Unisense微電極不僅能測量不同腸段之間的差異，還能在單個腸段內(nèi)進(jìn)行徑向掃描（從腸腔中心到腸壁）。雖然本文未展示徑向梯度圖，但該方法本身具備此能力。這種高空間分辨率使得研究者能夠探究更微觀的生境差異，理解微生物在微米尺度上的分布規(guī)律，這是任何混合取樣檢測方法都無法實(shí)現(xiàn)的。

 

為理解宿主-微生物共生互作的進(jìn)化提供了關(guān)鍵見解：測量數(shù)據(jù)表明，宿主通過進(jìn)化出具有不同物理化學(xué)特性的腸道結(jié)構(gòu)（如厚壁、分泌特定離子），主動地塑造了不同的微環(huán)境。這些微環(huán)境繼而選擇性地富集了能在此環(huán)境下生存并具有特定功能（如厭氧發(fā)酵）的微生物。因此，Unisense電極的數(shù)據(jù)從功能生態(tài)學(xué)的角度證明，宿主的“硬件”（腸道解剖結(jié)構(gòu)和生理）和“軟件”（微生物組）是協(xié)同進(jìn)化的，共同構(gòu)成了一個高效的消化系統(tǒng)，這可能是日本金龜子能適應(yīng)多種植物、成功入侵的關(guān)鍵。

 

綜上所述，丹麥Unisense微電極在本研究中扮演了“環(huán)境偵探”和“機(jī)理驗(yàn)證者”的關(guān)鍵角色。它提供的原位、高精度、定量的物理化學(xué)數(shù)據(jù)，成功地將抽象的“腸道分區(qū)”概念轉(zhuǎn)化為具體且可測量的環(huán)境參數(shù)，并令人信服地揭示了這些參數(shù)是驅(qū)動微生物群落組裝和功能分化的核心機(jī)制。沒有這些數(shù)據(jù)，本研究關(guān)于“微環(huán)境塑造菌群”的結(jié)論將停留在推測層面，其科學(xué)價值和深度將大打折扣。