Denitrification characterization of dissolved oxygen microprofiles in lake surface sediment through analyzing abundance, expression, community composition and enzymatic activities of denitrifier functional genes

基于反硝化功能基因豐度、表達(dá)、群落組成和酶活性分析湖泊表層沉積物溶解氧微剖面的反硝化特性

來(lái)源：Hong et al. AMB Expr (2019) 9:129

 

論文摘要

本研究通過(guò)響應(yīng)面法（RSM） 優(yōu)化了湖泊表層沉積物的反硝化條件，并基于溶解氧（DO）濃度將沉積物微層劃分為好氧層（AEZ）、缺氧層（HYZ）、上部厭氧層（ANZ-1）和下部厭氧層（ANZ-2）。利用定制亞毫米級(jí)采樣裝置結(jié)合qPCR、高通量測(cè)序和酶活性分析，系統(tǒng)研究了不同DO層中反硝化菌的豐度、基因表達(dá)、群落組成和酶活性特征。結(jié)果表明，反硝化特性在不同DO層間存在顯著差異：好氧層中norB、缺氧層中nirS、上部厭氧層中nosZ的DNA豐度和RNA表達(dá)水平最高。缺氧層和上部厭氧層是氮去除的活躍區(qū)域，其功能基因的豐度、表達(dá)和酶活性均最高。主要反硝化菌（如Azoarcus、Pseudogulbenkiania、Rhizobium）的豐度在不同層間差異顯著。環(huán)境因子（如TOC、TN、NH??-N、NO??-N）與反硝化基因豐度和表達(dá)顯著相關(guān)。此外，好氧和缺氧層中napA的豐度和表達(dá)較高，表明好氧反硝化菌在這些層中可能起重要作用。

研究目的

 

優(yōu)化反硝化條件：利用響應(yīng)面法（RSM）確定溫度、pH和鋸屑含量對(duì)沉積物反硝化效率（硝酸鹽去除率）的最佳組合。

解析反硝化菌的垂直分布特征：在亞毫米尺度上探究不同DO層（AEZ、HYZ、ANZ-1、ANZ-2）中反硝化菌的DNA豐度、RNA表達(dá)、酶活性和群落結(jié)構(gòu)的差異。

揭示環(huán)境驅(qū)動(dòng)機(jī)制：分析沉積物理化因子（如TOC、TN、氮形態(tài)）與反硝化過(guò)程的關(guān)聯(lián)，闡明不同DO層中反硝化菌的響應(yīng)策略。

 

評(píng)估好氧反硝化潛力：通過(guò)napA基因的分布，探討好氧反硝化在湖泊沉積物氮循環(huán)中的貢獻(xiàn)。

 

研究思路

研究采用“條件優(yōu)化-分層采樣-多組學(xué)整合-機(jī)制驗(yàn)證”的思路：

 

反硝化條件優(yōu)化：采用Box-Behnken設(shè)計(jì)（BBD）和RSM，測(cè)試溫度（5°C、15°C、25°C）、pH（5.5、7.0、8.5）和鋸屑含量（0.1、0.3、0.5 mg/110 g沉積物）對(duì)硝酸鹽去除率的影響，確定最佳條件（25°C、pH 8.5、鋸屑0.5 mg/110 g）。

微環(huán)境分層與采樣：使用定制裝置堆疊微孔板模擬沉積物柱，通過(guò)丹麥Unisense氧微電極測(cè)定DO垂直剖面（圖1b），據(jù)此劃分4個(gè)DO層（AEZ: 0-1.8 mm, DO 0.2-5.9 mg/L; HYZ: 1.8-2.2 mm, DO 0-0.2 mg/L; ANZ-1: 2.2-2.6 mm, DO 0 mg/L; ANZ-2: 2.6-3.0 mm, DO 0 mg/L）。在最佳條件下培養(yǎng)5天后，分層采集沉積物樣品。

 

多維度數(shù)據(jù)分析：

 

理化參數(shù)：測(cè)定NH??-N、NO??-N、NO??-N、TOC、TN（附加文件表S6）。

分子生物學(xué)分析：通過(guò)qPCR定量反硝化功能基因（narG、napA、nirS、nirK、norB、nosZ）的DNA豐度和RNA表達(dá)水平（圖3）；通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序分析nirS、nirK、nosZ的群落結(jié)構(gòu)（圖4）。

 

 

 

酶活性檢測(cè)：測(cè)定硝酸鹽還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）、氧化亞氮還原酶（NOS）的活性和電子傳輸系統(tǒng)（ETS）活性。

 

統(tǒng)計(jì)與機(jī)制驗(yàn)證：采用ANOVA、Pearson相關(guān)分析（圖4d）和ANOSIM，揭示環(huán)境因子與反硝化特性的關(guān)系，評(píng)估各層的氮去除功能。

 

測(cè)量數(shù)據(jù)及其研究意義（注明來(lái)源）

研究測(cè)量了多維度數(shù)據(jù)，其意義和來(lái)源如下：

 

硝酸鹽去除率及其優(yōu)化曲面：

 

意義：RSM分析表明溫度、鋸屑含量和pH共同影響反硝化效率，最佳條件為25°C、pH 8.5、鋸屑0.5 mg/110 g。溫度影響最大，鋸屑次之，證實(shí)有機(jī)碳和溫度是反硝化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。

 

來(lái)源：數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2及附加文件表S2、S4。

 

反硝化功能基因的DNA豐度與RNA表達(dá)水平：

 

意義：不同DO層優(yōu)勢(shì)基因不同（AEZ: norB; HYZ: nirS; ANZ-1: nosZ），表明反硝化路徑的空間分異。RNA表達(dá)在HYZ和ANZ-1層最高，提示這兩層是活性氮去除熱點(diǎn)。napA在好氧/缺氧層高表達(dá)，指示好氧反硝化潛力。

 

來(lái)源：數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3a、b。

 

反硝化酶活性（NAR、NIR、NOS）與ETS活性：

 

意義：NIR和NOS活性在HYZ和ANZ-1層最高，與基因表達(dá)一致，證實(shí)這些層的完整反硝化功能（NO??→N?）。ETS活性在深層（ANZ-2）降低，反映微生物代謝活性隨深度下降。

 

來(lái)源：數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3b及正文結(jié)果部分。

 

反硝化菌群落結(jié)構(gòu)：

 

意義：nirS型以Azoarcus為主，nirK型以Rhizobium為主，nosZ型以Pseudogulbenkiania為主。群落結(jié)構(gòu)在垂直層間差異顯著（ANOSIM, R2=0.35-0.67），表明DO梯度是群落分化的關(guān)鍵選擇壓力。

 

來(lái)源：數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4a-c及附加文件表S5。

 

環(huán)境因子與反硝化的相關(guān)性：

 

意義：NH??-N、NO??-N和TOC與反硝化基因豐度/表達(dá)顯著正相關(guān)（圖4d），證實(shí)氮源和有機(jī)碳是反硝化的主要限制因子。不同基因?qū)Νh(huán)境因子的響應(yīng)差異暗示功能冗余與生態(tài)位分化。

 

來(lái)源：數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4d及附加文件表S6。

 

研究結(jié)論

 

最佳反硝化條件：溫度25°C、pH 8.5、有機(jī)碳（鋸屑）0.5 mg/110 g沉積物可實(shí)現(xiàn)最高硝酸鹽去除率。

垂直分層效應(yīng)：反硝化菌的豐度、表達(dá)和活性具有明顯的垂直分帶性：好氧層（AEZ）以norB為標(biāo)志，缺氧層（HYZ）以nirS為標(biāo)志，上部厭氧層（ANZ-1）以nosZ為標(biāo)志。HYZ和ANZ-1層是氮去除最活躍的區(qū)域。

群落與環(huán)境耦合：反硝化菌群落結(jié)構(gòu)受DO梯度強(qiáng)烈篩選，環(huán)境因子（TOC、氮形態(tài)）與反硝化過(guò)程顯著相關(guān)，尤其驅(qū)動(dòng)了HYZ和ANZ-1層的高活性。

 

好氧反硝化作用：napA在好氧/缺氧層的高表達(dá)表明好氧反硝化菌可能對(duì)氮去除有重要貢獻(xiàn)，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)厭氧反硝化的認(rèn)知。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義詳細(xì)解讀

在本研究中，丹麥Unisense公司的氧微電極系統(tǒng)被用于原位測(cè)量沉積物柱的溶解氧（DO）垂直微剖面（方法部分2.3，數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1b），這是劃分沉積物微層和解釋反硝化空間分異的基石。

詳細(xì)研究意義如下：

 

實(shí)現(xiàn)亞毫米級(jí)環(huán)境分層：Unisense微電極具有微米級(jí)空間分辨率，能夠精確測(cè)定沉積物-水界面的DO濃度梯度。本研究利用該技術(shù)將僅3 mm厚的表層沉積物劃分為4個(gè)功能迥異的DO層（AEZ、HYZ、ANZ-1、ANZ-2）。沒(méi)有這種高精度測(cè)量，如此細(xì)微的生態(tài)位分異和后續(xù)的生物學(xué)分析將無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

為反硝化熱點(diǎn)的識(shí)別提供直接證據(jù)：DO剖面（圖1b）顯示，HYZ層（1.8-2.2 mm）的DO急劇降至0.2 mg/L以下，而ANZ-1層（2.2-2.6 mm）的DO為0。這為解釋為何HYZ和ANZ-1層出現(xiàn)反硝化基因（nirS、nosZ）表達(dá)和酶活性峰值提供了關(guān)鍵環(huán)境背景：HYZ的低氧條件激活了厭氧反硝化，而ANZ-1的嚴(yán)格厭氧環(huán)境確保了反硝化鏈的完成（N?O→N?）。

支撐“好氧反硝化”的新發(fā)現(xiàn)：在AEZ層（DO 0.2-5.9 mg/L），napA基因的高表達(dá)（圖3b）表明好氧反硝化過(guò)程的存在。Unisense數(shù)據(jù)直接證實(shí)了該層的有氧狀態(tài)，挑戰(zhàn)了“反硝化必須嚴(yán)格厭氧”的傳統(tǒng)認(rèn)知，為研究湖泊沉積物中好氧反硝化菌的生態(tài)功能提供了新的視角。

 

技術(shù)優(yōu)勢(shì)賦能機(jī)制解析：Unisense微電極的原位、無(wú)損測(cè)量避免了采樣擾動(dòng)，捕獲了真實(shí)的DO梯度。其高分辨率使得在毫米尺度上關(guān)聯(lián)“物理環(huán)境（DO）-微生物功能（基因表達(dá)）-生化過(guò)程（酶活性）”成為可能，極大地增強(qiáng)了對(duì)反硝化微觀機(jī)制的理解。

 

綜上所述，Unisense氧微電極獲得的數(shù)據(jù)是本研究的核心支撐。它不僅是簡(jiǎn)單測(cè)量DO濃度，更是定義研究尺度、解析過(guò)程機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象的關(guān)鍵工具，使研究者能夠?qū)⒎聪趸飳W(xué)響應(yīng)與微環(huán)境化學(xué)梯度精確耦合，最終得出具有高度空間分辨率的結(jié)論。