Calcium-Dependent Hydrogen Peroxide Mediates Hydrogen-Rich Water-Reduced Cadmium Uptake in Plant Roots

鈣依賴性過氧化氫介導富氫水減少植物根系鎘吸收

來源: Plant Physiology, Volume 183, July 2020, Pages 1331–1344

《植物生理學》第183卷，2020年7月，第1331–1344頁

 

摘要

摘要闡述了氫氣（H2）作為一種可能的信號分子，參與了許多植物發育和適應性反應，包括減輕鎘（Cd）從土壤中吸收的有害影響。本研究使用電生理學和分子生物學方法，探究了H2如何減輕小白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）中的Cd毒性。小白菜根系暴露于Cd后，細胞內H2產量迅速增加。外源施用富氫水（HRW）產生了耐Cd表型，減少了Cd的凈吸收和積累。研究表明，這一過程依賴于鈣離子（Ca2+）跨質膜的運輸以及由呼吸爆發氧化酶同系物BcRbohD介導的質外體過氧化氫（H2O2）生成。根系Cd吸收的減少與施用外源HRW或H2O2有關。這種減少效應在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的鐵調節轉運蛋白1（Atirt1）突變體中消失，并且經HRW預處理的小白菜顯示BcIRT1轉錄水平降低。暴露于HRW的根系出現快速的Ca2+內流，并且Cd誘導的Ca2+外漏得到緩解。兩種Ca2+通道阻斷劑釓離子（Gd3+）和鑭離子（La3+）消除了HRW誘導的BcRbohD表達增加、H2O2產生以及Cd2+內流抑制。總之，研究結果表明，H2對植物的Cd保護作用可能通過其控制由RbohD編碼的質膜NADPH氧化酶來解釋，該酶在IRT1上游起作用，并在轉錄和功能水平上調節根系Cd吸收。這些發現為H2減輕植物中Cd積累和毒性的緩解作用提供了機制性解釋。

 

研究目的

本研究旨在闡明氫氣（H2）/富氫水（HRW）如何通過信號導導機制減少植物（以小白菜和擬南芥為模式）根系對鎘（Cd）的吸收和積累，從而緩解Cd毒性的分子和生理機制。重點探究Ca2+和H2O2信號在此過程中的作用及其與下游Cd轉運蛋白（如IRT1）的調控關系。

 

研究思路

1.  表型驗證：首先驗證Cd脅迫下植物內源H2的產生，以及外源HRW處理對Cd脅迫下植物生長、細胞存活率、Cd吸收積累表型的影響。

2.  生理機制探索：使用非損傷微測技術（MIFE）測量根系關鍵位點（伸長區和成熟區）的Cd2+、Ca2+、H+、H2O2等離子/分子的實時凈流速變化，明確HRW對Cd2+內流的抑制作用。

3.  分子機制探索：

    a.  通過qRT-PCR分析HRW及Cd處理對關鍵基因（BcIRT1, BcZIP2, BcRbohD, BcRbohF）表達水平的影響。

    b.  使用藥理學抑制劑（DPI抑制NADPH氧化酶，Gd3+/La3+抑制Ca2+通道）干擾潛在信號通路，觀察對H2O2產生、基因表達及Cd吸收的影響。

    c.  利用擬南芥突變體（AtrbohD, AtrbohF, Atirt1）進行遺傳學驗證，確認RbohD和IRT1在HRW介導的Cd吸收減少中的必要性。

4.  信號整合：綜合所有數據，構建從H2信號感知到Ca2+內流，激活RbohD產生H2O2，進而抑制IRT1介導的Cd2+內流的信號導導模型。

 

測量的數據及研究意義

1.  內源H2釋放和含量（圖1）：使用Unisense H2微傳感器和氣相色譜（GC）測量。研究意義：證實Cd脅迫能快速、持續地誘導植物體內產生H2，提示H2可能作為響應Cd脅迫的早期信號分子。

 

2.  表型與細胞存活率（圖2）：測量根長、鮮重及FDA-PI熒光染色評估細胞存活率。研究意義：證明外源HRW處理能顯著緩解Cd抑制的生長并減少Cd引起的根尖細胞死亡，表明HRW具有保護作用。

 

3.  凈離子流速（圖3, 圖6, 圖7, 圖8, 圖9, 圖10C）：使用MIFE系統測量Cd2+、Ca2+、H+、H2O2的凈流速。研究意義：直接證明HRW預處理能顯著抑制Cd2+的內流；揭示了HRW能引發快速的Ca2+內流并緩解Cd引起的Ca2+外漏；顯示了HRW誘導的H2O2外流；證明了Rboh和IRT1突變體對HRW效應的喪失，從功能上驗證了這些組分在信號通路中的關鍵作用。

 

 

 

 

 

 

4.  Cd含量積累（圖4A,B; 圖10D）：使用原子吸收光譜法測量植物組織Cd含量。研究意義：證實HRW處理降低了根系和地上部的Cd積累量，與流速數據一致，表明其效應是生理相關的。

 

5.  基因表達水平（圖4C,D; 圖5E,F; 圖10A,B,E）：通過qRT-PCR分析BcIRT1, BcZIP2, BcRbohD, BcRbohF的轉錄本豐度。研究意義：表明HRW通過下調Cd轉運蛋白BcIRT1的轉錄來減少Cd吸收；揭示了HRW快速上調BcRbohD的表達，且該過程受Ca2+信號調控。

 

6.  H2O2和Ca2+熒光成像（圖5C,D; 圖9A,B,E,F inset）：使用H2DCFDA和Fluo-3/AM熒光探針進行化學染色和成像。研究意義：直觀地顯示了HRW和Cd處理對根內H2O2積累和Ca2+水平的影響，與微電極測量的流速數據相互印證。

7.  組織Ca含量：測量根組織Ca濃度。研究意義：證實HRW緩解了Cd引起的根內Ca流失，且該效應被Ca2+通道抑制劑阻斷，支持Ca2+流入的作用。

 

結論

1.  Cd脅迫能迅速誘導植物體內產生氫氣（H2）。

2.  外源施用富氫水（HRW）能有效緩解Cd脅迫對植物生長的抑制，減少根系對Cd2+的吸收和積累，并提高根尖細胞的存活率。

3.  HRW減少Cd吸收的效應依賴于一個信號導導通路：HRW首先引起快速的Ca2+內流；升高的胞內Ca2+激活質膜上的NADPH氧化酶（主要由RbohD編碼），導致質外體H2O2產生；H2O2作為信號分子，下調編碼Cd主要轉運蛋白的BcIRT1基因的表達，并抑制其功能活性，最終減少Cd2+的內流。

4.  該信號通路的各個環節（Ca2+內流、RbohD激活、H2O2產生、IRT1抑制）均通過藥理學抑制劑和遺傳突變體實驗得到了驗證。

5.  本研究揭示了H2作為一種氣體信號分子，通過Ca2+-H2O2信號模塊調控下游轉運蛋白表達和功能，從而減少Cd吸收的新機制，為利用HRW降低農作物Cd積累提供了理論基礎。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

本研究中使用丹麥Unisense公司的產品進行了兩項關鍵測量，其研究意義至關重要：

1.  H2微傳感器（Needle-type hydrogen sensor）：用于實時監測葉片組織中的H2釋放動態（圖1A）。研究意義：這項測量提供了直接證據，證明Cd脅迫能夠迅速（在300秒內）觸發植物體內H2的生成。這種高時間分辨率的原位測量技術，能夠捕捉到傳統方法（如氣相色譜）難以發現的早期、快速的H2信號變化。它首次將Cd脅迫與內源H2的產生直接、動態地聯系起來，確立了H2作為響應Cd脅迫的早期信號分子的地位，為整個研究的立論奠定了基礎。

2.  H2O2微電極（H2O2-sensitive microelectrode）：用于測量根系質外體H2O2的凈流速（圖5A, B）。研究意義：與熒光染色（顯示積累量）不同，微電極能夠非損傷、實時地監測H2O2在根表界的動態流動（flux）。這些數據清晰地顯示，HRW預處理能誘導H2O2的外排（efflux），并且這種外排在Cd刺激后進一步增強。這提供了功能性的證據，表明HRW確實激活了質膜上產生H2O2的機制（如NADPH氧化酶），并將H2O2釋放到質外體空間發揮作用。這些實時流速數據與藥理學實驗（DPI抑制）、基因表達分析（BcRbohD上調）以及突變體表型（AtrbohD無效）完美結合，共同且強有力地證明了RbohD介導的H2O2產生是HRW抑制Cd吸收的關鍵中間步驟。

 

總之，Unisense微傳感器提供的高時間分辨率和原位實時監測能力，使得研究者能夠精確地捕捉到H2和H2O2這兩種關鍵信號分子在應激反應初期的瞬時動態變化。這些數據不僅是簡單的濃度記錄，更是揭示信號通路啟動順序和因果關系的核心證據，將H2信號的產生、Ca2+的響應、H2O2的生成以及最終的Cd2+流入抑制串聯成一個清晰、可信的因果鏈條，極大地增強了對H2調控Cd吸收機制理解的深度和可靠性。