External α-carbonic anhydrase and solute carrier 4 (SLC4) are required for HCO?? uptake in a freshwater angiosperm  

淡水被子植物吸收HCO??需要外部α-碳酸酐酶和溶質(zhì)載體4（SLC4）  

來源：Journal of Experimental Botany, Volume 71, Issue 19, 2020, Pages 6004–6014 

《實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志》，第71卷，第19期，2020年，頁碼6004–6014

 

摘要  

淡水單子葉植物水車前（Ottelia alismoides）是已知唯一能操作三種CO?濃縮機(jī)制（CCMs）的物種：組成型HCO??利用和C4光合作用，以及兼性景天酸代謝（CAM），但其HCO??利用機(jī)制未知。本研究發(fā)現(xiàn)，陰離子交換（AE）蛋白抑制劑DIDS阻止了HCO??利用，也對CO?吸收有輕微影響。外部碳酸酐酶（CA）抑制劑乙酰唑胺（AZ）降低了CO?吸收的親和力，也通過影響AE蛋白阻止了HCO??利用。mRNA轉(zhuǎn)錄本分析鑒定出負(fù)責(zé)HCO??轉(zhuǎn)運(yùn)的溶質(zhì)載體4（SLC4）同源物（可能是DIDS的靶點(diǎn)）和一個(gè)周質(zhì)的α-CA1。通過模型量化三種不同無機(jī)碳（Ci）吸收途徑的貢獻(xiàn)表明，在高CO?濃度下，被動(dòng)CO?擴(kuò)散主導(dǎo)Ci吸收。然而，隨著CO?濃度降低，另外兩種途徑變得主導(dǎo)：由α-CA1在質(zhì)膜上將HCO??轉(zhuǎn)化為CO?，以及由SLC4轉(zhuǎn)運(yùn)HCO??穿過質(zhì)膜。這些機(jī)制使得該物種能夠利用無機(jī)碳庫中更大部分，并在生產(chǎn)力高的生態(tài)系統(tǒng)中碳嚴(yán)重耗盡時(shí)期持續(xù)進(jìn)行光合作用。

 

研究目的  

本研究旨在揭示淡水水生植物水車前（Ottelia alismoides）利用碳酸氫根（HCO??）進(jìn)行光合作用的具體分子機(jī)制。重點(diǎn)探究外部碳酸酐酶（CAext）和陰離子交換蛋白（如SLC4家族成員）是否以及如何參與HCO??的吸收過程，并量化在不同CO?濃度下，被動(dòng)CO?擴(kuò)散、CA介導(dǎo)的HCO??轉(zhuǎn)化和直接HCO??轉(zhuǎn)運(yùn)這三種途徑對總無機(jī)碳（Ci）吸收的相對貢獻(xiàn)。

 

研究思路  

1.  生理實(shí)驗(yàn)（pH漂移與抑制劑）：利用pH漂移技術(shù)，在密閉系統(tǒng)中監(jiān)測水車前葉片光合作用引起的pH變化和Ci消耗，以評估其HCO??利用能力。在實(shí)驗(yàn)中分別加入特異性抑制劑：乙酰唑胺（AZ，抑制外部碳酸酐酶CAext）和DIDS（抑制陰離子交換蛋白AE/SLC4），觀察它們對Ci吸收動(dòng)力學(xué)、最終pH、CO?補(bǔ)償點(diǎn)等參數(shù)的影響，以判斷這兩種機(jī)制的作用。

2.  酶活檢測：直接測量葉片外部碳酸酐酶（CAext）的活性，并驗(yàn)證AZ和DIDS對其活性的影響。

3.  分子生物學(xué)分析（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）：對適應(yīng)高CO?（HC）和低CO?（LC）條件的水車前葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（包括二代和三代測序），鑒定與Ci吸收相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄本，特別是編碼α-碳酸酐酶（α-CA）和SLC4家族HCO??轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，并分析其表達(dá)量在不同CO?條件下的差異。

4.  建模與量化：基于抑制劑實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，建立一個(gè)模型來量化并解析三種Ci吸收途徑（CO?被動(dòng)擴(kuò)散、CAext介導(dǎo)的HCO??轉(zhuǎn)化、SLC4介導(dǎo)的HCO??直接轉(zhuǎn)運(yùn)）在不同溶解CO?濃度下的相對貢獻(xiàn)率。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義  

1.  pH漂移終點(diǎn)參數(shù)（來自圖1）：測量了對照組和抑制劑（AZ, DIDS）處理組的最終pH值（圖1A）、最終CO?濃度（圖1B）。該數(shù)據(jù)直接證明了水車前具有強(qiáng)大的HCO??利用能力（對照組最終pH極高，CO?極低），而AZ和DIDS處理均抑制了這種能力，表明CAext和AE蛋白是HCO??利用所必需的。

 

2.  Ci吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)（來自圖1C, D, E；圖2）：計(jì)算了Ci吸收速率對CO?濃度的初始斜率（反映親和力，圖1C）、CO?補(bǔ)償點(diǎn)（圖1D）、以及Ci/堿度比值（反映對Ci庫的利用效率，圖1E）。圖2展示了不同CO?濃度下的Ci吸收速率及抑制率。這些數(shù)據(jù)揭示了AZ和DIDS如何特異性影響Ci吸收的不同環(huán)節(jié)（如AZ顯著降低吸收親和力并提高補(bǔ)償點(diǎn)），為區(qū)分三種吸收途徑提供了關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)依據(jù)。

 

3.  CAext酶活性數(shù)據(jù)（來自圖4C, D）：直接測量了葉片CAext的活性（圖4C）以及AZ和DIDS對活性的抑制效果（圖4D）。該數(shù)據(jù)從生化水平證實(shí)了CAext的存在及其對AZ的敏感性，而DIDS不抑制CAext活性，表明兩者作用靶點(diǎn)不同。

 

4.  基因表達(dá)數(shù)據(jù)（來自圖5）：通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，獲得了編碼α-CA1（圖5A）和SLC4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖5B）的基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量（RPKM/FPKM）。該數(shù)據(jù)從分子水平證實(shí)了這些關(guān)鍵基因的存在，并且它們的表達(dá)在不同CO?條件下（HC vs LC）沒有顯著差異，與水車前“組成型”HCO??利用能力的生理現(xiàn)象相一致。

 

5.  抑制劑可逆性驗(yàn)證數(shù)據(jù)（來自圖3）：通過清洗去除AZ后，Ci吸收速率得以恢復(fù)。該數(shù)據(jù)證明了AZ的作用是可逆的，且其作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞外部（無法進(jìn)入細(xì)胞），排除了其對內(nèi)部酶的非特異性抑制，強(qiáng)有力地支持了CAext是其主要作用靶點(diǎn)。

 

結(jié)論  

1.  水車前（Ottelia alismoides）利用HCO??依賴于兩種關(guān)鍵機(jī)制：位于質(zhì)膜外部的α-碳酸酐酶1（α-CA1）將HCO??催化脫水生成CO?以供擴(kuò)散吸收，以及溶質(zhì)載體4（SLC4）家族蛋白直接轉(zhuǎn)運(yùn)HCO??進(jìn)入細(xì)胞。

2.  這兩種機(jī)制是“組成型”表達(dá)的，其基因轉(zhuǎn)錄水平和功能活性不受環(huán)境CO?濃度（高或低）的顯著誘導(dǎo)或抑制。

3.  三種Ci吸收途徑的貢獻(xiàn)隨環(huán)境CO?濃度動(dòng)態(tài)變化：在高CO?條件下（~50μM），被動(dòng)CO?擴(kuò)散是主要途徑（貢獻(xiàn)~55.7%）；隨著CO?降低至近空氣平衡值（~9μM），CAext介導(dǎo)的途徑成為主導(dǎo)（貢獻(xiàn)~64.4%）；當(dāng)CO?濃度極低（~1μM）時(shí)，被動(dòng)擴(kuò)散失效，CAext和SLC4介導(dǎo)的途徑共同支撐Ci吸收（各貢獻(xiàn)約50%）。

4.  該研究首次在淡水水生被子植物中提供了SLC4家族HCO??轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與Ci吸收的直接分子和生理證據(jù)，深化了對水生植物碳濃縮機(jī)制多樣性的理解。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義  

在本研究的pH漂移實(shí)驗(yàn)中，使用了丹麥Unisense公司生產(chǎn)的氧敏感微電極（Oxygen electrode, model OX-13298）與Unisense微傳感器多功能表（Unisense microsensor multimeter）相連，用于監(jiān)測反應(yīng)室中的溶解氧（O?）濃度。其研究意義在于：

1.  控制實(shí)驗(yàn)條件：在pH漂移實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，通過向反應(yīng)室充入氮?dú)猓∟?），將初始溶解氧濃度降低并穩(wěn)定在約100 μM（約為空氣飽和度的40%）。精確控制氧分壓至關(guān)重要，因?yàn)檠鯕馐枪夂献饔玫母偁幮缘孜铮錆舛葧?huì)影響Rubisco酶的活性（催化羧化與加氧反應(yīng)），從而影響測得的CO?補(bǔ)償點(diǎn)和Ci吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的準(zhǔn)確性。

2.  確保數(shù)據(jù)可靠性：通過實(shí)時(shí)監(jiān)測并維持較低且穩(wěn)定的O?水平，可以最大限度地減少光呼吸作用的影響，確保觀察到的pH變化和Ci消耗 primarily 是由光合碳固定驅(qū)動(dòng)的，從而使得基于pH漂移數(shù)據(jù)計(jì)算的Ci吸收速率、CO?補(bǔ)償點(diǎn)等關(guān)鍵參數(shù)更能真實(shí)反映CCM的運(yùn)行效率，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

3.  技術(shù)優(yōu)勢：Unisense氧電極具有高靈敏度和快速響應(yīng)時(shí)間，能夠?qū)崟r(shí)、連續(xù)、精確地監(jiān)測微小反應(yīng)體系中溶解氧的微小變化，這是傳統(tǒng)離線采樣方法無法實(shí)現(xiàn)的，為精細(xì)調(diào)控實(shí)驗(yàn)環(huán)境提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。

 

綜上所述，Unisense氧電極的應(yīng)用并非直接測量碳代謝參數(shù)，而是通過精確控制和分析實(shí)驗(yàn)中的氧環(huán)境這一關(guān)鍵變量，為準(zhǔn)確解析水車前無機(jī)碳吸收機(jī)制提供了必要且可靠的實(shí)驗(yàn)條件保障。