Enrichment and physiological characterization of a novel comammox Nitrospira indicates ammonium inhibition of complete nitrification

新型 comammox Nitrospira 的富集和生理特性表明銨抑制完全硝化作用

來源：The ISME Journal (2021) 15:1010–1024

 

一、摘要概述

 

本研究通過 連續膜生物反應器富集 獲得一種新型完全氨氧化（comammox）硝化螺菌（Nitrospira），暫命名為 “Candidatus Nitrospira kreftii”。研究通過基因組和生理表征發現：

 

超高底物親和力：氨親和力（Km(app) NH3≈0.040±0.01 μM）高于已知comammox菌，亞硝酸鹽親和力（Km(app) NO2?=12.5±4.0 μM）表明其適應貧營養環境。

銨抑制現象：低至 25 μM 銨濃度 即部分抑制氨氧化活性（圖4, 圖6），首次揭示comammox菌的銨敏感性。

 

 

生態位分化：銨耐受性差異可能是comammox菌種間競爭的關鍵因素。

 

二、研究目的

 

富集新型comammox菌：填補comammox菌純培養稀缺的空白（此前僅 N. inopinata 一株）。

解析生理特性：探究底物親和力、抑制閾值等參數，揭示生態適應性。

驗證銨抑制機制：闡明銨濃度對完全氨氧化的調控作用。

 

三、研究思路

 

采用 “富集培養→基因組分析→生理表征” 的三步策略：

 

富集培養：

利用 連續膜生物反應器（5L容積）在低氨（≤2.5 mM）、50%氧飽和條件下培養39個月。

接種源含兩種comammox菌（原占比15%），最終富集至 90% Nitrospira（圖1）。

 

基因組解析：

宏基因組+納米孔測序 獲得完整基因組（4.13 Mb，GC含量54.5%）。

系統發育分析確認其為 comammox clade A新種（圖2），命名“Ca. N. kreftii”。

 

代謝重構顯示完整氨氧化通路（AMO/HAO/NXR）及尿素利用潛力（圖3）。

 

生理表征：

微呼吸測量技術（Unisense電極）定量氨/亞硝酸鹽氧化動力學。

分析銨抑制效應及菌膠團尺寸對底物親和力的影響（圖4-7）。

 

 

四、關鍵數據及研究意義

1. 微生物群落動態（圖1）

 

數據來源：FISH定量顯示富集過程中 Nitrospira 占比從15%升至90%（表S2）。

意義：證實低氨連續培養可高效富集comammox菌，為后續生理研究提供高純度生物量。

 

2. 基因組特征（圖2, 圖3）

 

數據來源：

系統發育樹（圖2）顯示“Ca. N. kreftii”屬于comammox clade A，與“Ca. N. nitrificans”親緣最近（77% ANI）。

代謝通路圖（圖3）證實完整氨氧化酶系（AMO/HAO/NXR）及氫酶（HYD）等輔助功能。

意義：提供第二個comammox菌完整基因組，揭示保守的氨氧化機制及獨特的鈉泵適應機制。

 

3. 氨氧化動力學與銨抑制（圖4, 圖6）

 

數據來源：Unisense電極測定耗氧率，擬合Haldane抑制模型：

超高氨親和力：Km(app) NH3=0.040±0.01 μM（圖4）。

銨抑制閾值：>25 μM銨顯著降低氧化速率，抑制常數 Ki(app)=245.7±98.7 μM（圖6）。

意義：首次發現comammox菌的銨抑制現象，挑戰“comammox僅適應貧營養”的認知。

 

4. 亞硝酸鹽氧化動力學（圖5, 圖7）

 

數據來源：Michaelis-Menten模型擬合：

高亞硝酸鹽親和力：Km(app) NO2?=12.5±4.0 μM（圖5）。

無抑制現象（圖7）。

意義：comammox菌亞硝酸鹽親和力顯著高于 N. inopinata（449 μM），表明種間分化。

 

5. 菌膠團尺寸效應（圖4-7）

 

數據來源：菌膠面積（5.5±10.4 μm2）與 Km(app) 正相關（r=0.84,p=0.038）。

意義：擴散限制導致表觀親和力低估，需在生理模型中校正生物聚集體效應。

 

五、結論

 

新型comammox資源：“Ca. N. kreftii”是第二個高純度富集的comammox菌，拓展了硝化微生物資源庫。

雙高親和力：其氨（0.04 μM）和亞硝酸鹽（12.5 μM）親和力均優于多數AOB/AOA（圖8），適應極端貧營養環境。

 

銨抑制的生態意義：銨抑制閾值（25 μM）低于所有已知硝化菌，表明 銨耐受性差異 是comammox菌種間生態位分化的關鍵因素。

技術啟示：連續膜生物反應器是富集慢速生長硝化菌的有效策略。

 

六、丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

1. 技術原理與實驗設計

 

原理：Unisense氧電極（RC-350呼吸室 + PA2000皮安計）基于 克拉克電極原理，通過鉑陰極還原溶解氧產生電流信號，靈敏度達 nM級。

實驗設計：

生物量洗滌后懸浮于HEPES緩沖液，注入NH?Cl/NaNO?啟動反應。

實時監測 耗氧率，通過化學計量比（NH??:O? = 1:1.96）反推底物氧化速率（圖4-7）。

 

2. 關鍵結果與意義

 

氨氧化動力學：

非線性擬合揭示 銨抑制現象（圖6a, c, e），推翻傳統Michaelis-Menten模型。

抑制常數（Ki）定量為 191.9±68.5 μM NH??，為環境氮循環模型提供關鍵參數。

亞硝酸鹽氧化：

線性動力學（圖5, 圖7），證實comammox菌獨立完成全程硝化。

生物學意義：

首次證實comammox菌的銨敏感性，修正“comammox僅受貧營養選擇”的理論。

超高靈敏度檢測 瞬態代謝響應，揭示底物波動下（如污水處理廠）comammox活性調控機制。

技術創新價值：

微升級反應體系（2 mL）減少樣品量需求，適用于難培養微生物的生理表征。

實時動態監測 彌補靜態基因組分析的不足，為合成微生物群落構建提供依據。

 

七、研究突破與局限

 

理論創新：

提出 “銨耐受性分化”假說，解釋comammox菌在氮循環中的生態位分配。

修正comammox底物親和力范圍（圖8），豐富貧營養微生物生理數據庫。

技術突破：

納米孔測序獲得 首個“Ca. N. kreftii”完整基因組。

Unisense電極實現 高時空分辨率生理監測。

局限：

未獲得純培養，抑制機制未在分子水平驗證。

菌膠團效應可能低估真實底物親和力。

 

圖表示例說明：

 

圖1（群落動態）展示富集過程中 Nitrospira 占比變化。

圖2（系統發育）定位新菌分類地位。

圖3（代謝通路）注釋關鍵酶功能。

圖4-7（動力學曲線）量化底物親和力與抑制效應。

圖8（親和力對比）突顯新菌生理獨特性。