Nitric-oxide-driven oxygen release in anoxic Pseudomonas aeruginosa

缺氧銅綠假單胞菌中一氧化氮驅(qū)動(dòng)的氧釋放

來(lái)源：iScience 24,103404，December 17, 2021

 

一、摘要概述

 

本研究通過(guò)微呼吸測(cè)量技術(shù)發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在缺氧起始階段會(huì)釋放氧氣（O?），并證明該過(guò)程由一氧化氮（NO）驅(qū)動(dòng)：

 

O?釋放現(xiàn)象：在密閉培養(yǎng)體系中，野生型（WT）和△norB突變株（缺失一氧化氮還原酶）在缺氧起始階段均出現(xiàn)O?峰值（圖3）。

 

NO的核心作用：

NO??補(bǔ)充或NO供體（DPTA NONOate）可顯著放大O?峰值（圖4、圖6）。

 

 

 

△nirS-N突變株（無(wú)法產(chǎn)生NO）在NO??刺激下無(wú)O?釋放，但直接添加NO供體可恢復(fù)該現(xiàn)象（圖6）。

生理意義：NO介導(dǎo)的O?釋放可能幫助細(xì)菌適應(yīng)缺氧環(huán)境，支持其從有氧到無(wú)氧代謝的過(guò)渡。

 

二、研究目的

 

探究NO歧化酶活性：驗(yàn)證銅綠假單胞菌是否具有類(lèi)似Methylomirabilis oxyfera的NO歧化酶（Nod），能將NO轉(zhuǎn)化為O?和N?。

解析O?釋放機(jī)制：闡明NO在缺氧起始階段觸發(fā)O?釋放的分子途徑。

評(píng)估生理適應(yīng)性：揭示該現(xiàn)象對(duì)細(xì)菌在動(dòng)態(tài)缺氧環(huán)境中生存的意義。

 

三、研究思路

 

采用 “表型觀(guān)察→突變體驗(yàn)證→NO調(diào)控驗(yàn)證” 策略：

 

表型發(fā)現(xiàn)：

密閉培養(yǎng)體系中，WT和△norB突變株在初始O?耗盡后出現(xiàn)O?峰值（圖3）。

△norB突變株因NO積累，O?峰值顯著高于WT（圖4）。

NO作用驗(yàn)證：

添加NO??（NO前體）或NO供體均放大O?峰值（圖4、圖6）。

△nirS-N突變株（無(wú)法產(chǎn)NO）僅在直接添加NO供體時(shí)釋放O?（圖6）。

排除干擾因素：

無(wú)氧啟動(dòng)的培養(yǎng)中無(wú)O?峰值（圖4），證明需初始O?觸發(fā)。

電極同步測(cè)量顯示NO上升先于O?釋放（圖7），證實(shí)時(shí)序關(guān)系。

 

 

四、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. O?釋放的NO依賴(lài)性（圖4、圖6）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：微呼吸測(cè)定O?濃度（圖4）、突變體表型（圖6）。

結(jié)果：

△norB突變株的O?峰值比WT高4倍（23.1 μM vs. 5.8 μM）。

NO供體（DPTA NONOate）使△nirS-N突變株恢復(fù)O?釋放能力。

意義：NO是O?釋放的直接觸發(fā)因子，且與Nor酶活性負(fù)相關(guān)。

 

2. 初始O?的必要性（圖4）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：有氧/無(wú)氧啟動(dòng)培養(yǎng)對(duì)比。

結(jié)果：僅在有氧啟動(dòng)的培養(yǎng)中檢測(cè)到O?峰值。

意義：O?釋放依賴(lài)于從有氧到無(wú)氧的代謝轉(zhuǎn)換過(guò)程。

 

3. NO與O?釋放的時(shí)序關(guān)系（圖7）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：Unisense微電極同步測(cè)量O?和NO濃度。

結(jié)果：NO濃度上升后立即出現(xiàn)O?峰值（時(shí)間差<5分鐘）。

意義：直接證明NO積累是O?釋放的前置事件。

 

4. 無(wú)Nod同源基因的證據(jù)

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：基因組BLAST分析。

結(jié)果：未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似M. oxyfera的Nod同源基因。

意義：O?釋放可能通過(guò)未知酶促途徑或非經(jīng)典機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

 

五、結(jié)論

 

NO驅(qū)動(dòng)O?釋放：銅綠假單胞菌在缺氧起始階段通過(guò)NO積累觸發(fā)O?釋放，△norB突變株因NO累積放大該效應(yīng)。

生理適應(yīng)性：釋放的O?可能幫助細(xì)菌：

激活有氧代謝相關(guān)基因（如高親和力末端氧化酶）。

緩解缺氧壓力，支持從有氧到無(wú)氧呼吸的過(guò)渡。

生態(tài)意義：該機(jī)制或減少溫室氣體N?O排放（因繞過(guò)反硝化途徑）。

 

六、丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

1. 技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

 

原理：Unisense微電極采用安培法，通過(guò)氧依賴(lài)性電化學(xué)還原反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)溶解氧（分辨率達(dá)μM級(jí)）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

使用雙腔室玻璃反應(yīng)器（圖7B），內(nèi)置O?和NO微電極。

同步監(jiān)測(cè)△norB突變株在添加NO??后的O?/NO動(dòng)態(tài)變化（37°C，持續(xù)攪拌）。

 

2. 關(guān)鍵結(jié)果（圖7）

 

數(shù)據(jù)定位：圖7A（O?/NO濃度時(shí)序圖）。

結(jié)果：

NO先于O?上升：NO濃度在O?耗盡后迅速升高，峰值達(dá)15 μM。

O?釋放緊隨其后：NO達(dá)峰后5分鐘內(nèi)，O?濃度從0升至8 μM。

無(wú)外部O?干擾：密閉系統(tǒng)排除大氣O?擴(kuò)散可能。

意義：

首次在細(xì)菌中捕獲NO→O?的實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)，為NO驅(qū)動(dòng)O?釋放提供直接證據(jù)。

揭示該過(guò)程的瞬態(tài)特征（峰值維持約10分鐘），解釋傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)的原因。

 

3. 研究?jī)r(jià)值

 

技術(shù)創(chuàng)新：

實(shí)現(xiàn)雙參數(shù)（O?/NO）原位同步監(jiān)測(cè)，突破單參數(shù)測(cè)量的局限性。

微米級(jí)空間分辨率避免樣品破壞，捕捉到傳統(tǒng)宏量分析遺漏的瞬態(tài)事件。

生物學(xué)啟示：

證實(shí)銅綠假單胞菌存在跨界代謝靈活性（有氧/無(wú)氧代謝耦合）。

為理解細(xì)菌在宿主缺氧環(huán)境（如囊性纖維化肺部）的適應(yīng)性提供新視角。

 

七、研究意義與局限

 

理論創(chuàng)新：

發(fā)現(xiàn)首個(gè)病原菌中NO驅(qū)動(dòng)的O?釋放現(xiàn)象，拓展對(duì)細(xì)菌代謝可塑性的認(rèn)知。

提出“NO介導(dǎo)的微氧爆發(fā)”模型，解釋細(xì)菌在動(dòng)態(tài)缺氧環(huán)境中的生存策略。

應(yīng)用潛力：

為抗生物膜策略提供新靶點(diǎn)（如干擾NO信號(hào)通路）。

啟示優(yōu)化污水處理中反硝化工藝以減少N?O排放。

局限：

未明確O?釋放的酶學(xué)機(jī)制（需同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）。

未解析相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（需轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步研究）。

 

圖表示例嵌入說(shuō)明：

 

圖3（O?動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)）嵌入“表型發(fā)現(xiàn)”部分

圖4（突變體O?峰值）嵌入“NO依賴(lài)性”章節(jié)

圖6（NO供體效應(yīng)）嵌入“機(jī)制驗(yàn)證”章節(jié)

圖7（O?/NO同步監(jiān)測(cè)）嵌入“Unisense電極”核心分析