Alanine cross-feeding determines Escherichia coli colony growth dynamics

丙氨酸交叉喂養(yǎng)決定大腸桿菌菌落生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

來源：bioRxiv Preprint · February 2021  DOI: 10.1101/2021.02.28.433255

 

一、摘要概述

 

本研究揭示了大腸桿菌菌落生物膜中丙氨酸交叉喂養(yǎng)的空間代謝機(jī)制。核心發(fā)現(xiàn)包括：

 

空間代謝分區(qū)：菌落底部厭氧區(qū)細(xì)胞（接觸富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基）通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AlaE分泌丙氨酸；中部需氧區(qū)細(xì)胞（營(yíng)養(yǎng)匱乏）通過DadA/DadX利用丙氨酸作為碳氮源（圖2D-E）。

 

交叉喂養(yǎng)的生理效應(yīng)：丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺失突變體（△alaE△dadAX）導(dǎo)致菌落中部細(xì)胞死亡率↑（圖4A），生長(zhǎng)速率↓（圖5C），并改變菌落形態(tài)（圖5A-B）。

 

 

代謝梯度驅(qū)動(dòng)：氧梯度（圖2A）和營(yíng)養(yǎng)梯度共同塑造亞群分工，丙氨酸作為關(guān)鍵交叉喂養(yǎng)代謝物維持群落穩(wěn)定性。

 

二、研究目的

 

無(wú)偏識(shí)別交叉喂養(yǎng)：通過時(shí)空多組學(xué)解析菌落生物膜中的代謝互作。

驗(yàn)證丙氨酸的核心作用：探究其分泌與利用的空間調(diào)控機(jī)制。

闡明代謝互作對(duì)群落結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)：揭示丙氨酸交叉喂養(yǎng)如何影響菌落生長(zhǎng)與細(xì)胞存活。

 

三、研究思路

 

采用 “多組學(xué)+空間分辨驗(yàn)證” 策略：

 

表型觀察：

菌落生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)（體積/高度/直徑）顯示24h為代謝轉(zhuǎn)換點(diǎn)（圖1B）。

 

全菌落轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)丙氨酸代謝基因（alaE, dadAX）顯著上調(diào)（圖1D）。

空間分辨機(jī)制解析：

氧梯度測(cè)量：Unisense微電極確認(rèn)菌落內(nèi)部缺氧區(qū)（圖2A）。

空間轉(zhuǎn)錄組：FACS分選熒光（需氧）與非熒光（厭氧）細(xì)胞，揭示alaE在厭氧區(qū)高表達(dá)，dadAX在需氧區(qū)高表達(dá)（圖2E）。

功能驗(yàn)證：

代謝組證實(shí)厭氧條件下丙氨酸分泌（圖3A）。

 

基因敲除（△alaE△dadAX）導(dǎo)致菌落中部細(xì)胞死亡↑（圖4A）和生長(zhǎng)缺陷（圖5C）。

 

四、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. 菌落生長(zhǎng)與代謝動(dòng)態(tài)（圖1）

 

數(shù)據(jù)來源：菌落形態(tài)測(cè)量（圖1B）、全菌落轉(zhuǎn)錄組（圖1C）、代謝組（圖1E-F）。

結(jié)果：

24h后生長(zhǎng)速率下降（線性→指數(shù)轉(zhuǎn)換），伴隨966基因差異表達(dá)（圖1C）。

丙氨酸為唯一峰值出現(xiàn)在32h的氨基酸（圖1F）。

意義：確立代謝轉(zhuǎn)換時(shí)間點(diǎn)，鎖定丙氨酸為關(guān)鍵代謝物。

 

2. 空間代謝分區(qū)（圖2, 圖5）

 

數(shù)據(jù)來源：

Unisense氧微電極測(cè)量菌落氧梯度（圖2A）。

空間轉(zhuǎn)錄組（FACS分選+RNA-seq）（圖2E）。

菌落形態(tài)與生長(zhǎng)速率成像（圖5A-C）。

結(jié)果：

氧濃度從表層200μM降至100μm深處接近0（圖2A）。

厭氧區(qū)alaE表達(dá)↑50倍，需氧區(qū)dadAX表達(dá)↑5倍（圖2E）。

△alaE△dadAX突變體菌落曲率↓30%（圖5B），生長(zhǎng)速率↓40%（圖5C）。

意義：首次實(shí)現(xiàn)菌落內(nèi)部代謝亞群的空間定位，證實(shí)代謝互作依賴微環(huán)境梯度。

 

3. 丙氨酸交叉喂養(yǎng)的功能（圖3-4）

 

數(shù)據(jù)來源：代謝組（圖3A, 4B）、細(xì)胞存活率（SYTOX染色）（圖4A）、生長(zhǎng)曲線（圖4C-D）。

結(jié)果：

厭氧+富營(yíng)養(yǎng)條件下丙氨酸分泌↑20倍（圖3A）。

△alaE△dadAX突變體胞外丙氨酸累積↑3倍（圖4B），細(xì)胞死亡率↑2.5倍（圖4A）。

外源丙氨酸抑制△alaE△dadAX生長(zhǎng)（圖4C），靜止期死亡率↑80%（圖4D）。

意義：證明丙氨酸既是營(yíng)養(yǎng)載體（碳氮源），又是毒性調(diào)節(jié)因子，缺失導(dǎo)致代謝失衡。

 

五、結(jié)論

 

代謝分區(qū)模型：菌落底部（厭氧）分泌丙氨酸 → 中部（需氧）消耗丙氨酸，形成空間代謝循環(huán)（圖5D）。

交叉喂養(yǎng)的生態(tài)功能：丙氨酸作為“代謝貨幣”維持營(yíng)養(yǎng)匱乏區(qū)細(xì)胞存活，塑造菌落三維結(jié)構(gòu)。

方法論創(chuàng)新：時(shí)空多組學(xué)+微電極技術(shù)為微生物群落代謝互作研究提供新范式。

 

六、丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

1. 技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

 

原理：

Clark型微電極（25μm尖端）通過電化學(xué)還原反應(yīng)實(shí)時(shí)測(cè)量溶解氧（μM級(jí)分辨率）。

兩點(diǎn)校準(zhǔn)：空氣飽和水（高氧）vs. 抗壞血酸鈉（零氧）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

垂直掃描72h菌落（5μm步進(jìn)），每點(diǎn)測(cè)量3秒（圖2A）。

同步驗(yàn)證：mRuby2熒光強(qiáng)度與氧濃度高度相關(guān)（R2=0.97）。

 

2. 關(guān)鍵結(jié)果（圖2A）

 

氧梯度特征：

表層（0-30μm）：氧濃度≈200 μM（近大氣飽和）。

中層（100μm）：氧濃度≈20 μM（缺氧閾值）。

深層（>150μm）：氧濃度≈0 μM（完全厭氧）。

生物學(xué)意義：

定量界定代謝分區(qū)：需氧區(qū)（<100μm）vs. 厭氧區(qū)（>100μm）。

解釋空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果：缺氧驅(qū)動(dòng)alaE在深層表達(dá)，氧充足驅(qū)動(dòng)dadAX在表層表達(dá)。

 

3. 研究?jī)r(jià)值

 

技術(shù)創(chuàng)新：克服傳統(tǒng)方法（如熒光染料）的光穿透限制，實(shí)現(xiàn)高分辨率原位氧測(cè)繪。

生物學(xué)啟示：

揭示菌落內(nèi)部微米級(jí)代謝微環(huán)境異質(zhì)性。

為理解生物膜中代謝互作的空間尺度提供直接證據(jù)。

 

七、研究意義

 

理論突破：

發(fā)現(xiàn)首個(gè)由單菌代謝分區(qū)驅(qū)動(dòng)的交叉喂養(yǎng)案例（丙氨酸）。

提出“代謝梯度決定群落空間結(jié)構(gòu)”新模型（圖5D）。

應(yīng)用價(jià)值：

為調(diào)控生物膜（如抗生物膜策略）提供代謝靶點(diǎn)（如alaE抑制劑）。

啟示合成微生物群落的空間工程設(shè)計(jì)原則。

技術(shù)貢獻(xiàn)：

建立“微電極+空間組學(xué)”研究范式，可推廣至其他微生物體系。