Electron Transfer to the Trinuclear Copper Cluster in Electrocatalysis by the Multicopper Oxidases  

多銅氧化酶電催化中電子向三核銅簇的轉移機制  

來源：J. Am. Chem. Soc. 2021, 143(41), 17236-17249

《美國化學會志》2021年 第143卷 第41期17236-17249頁  

 

摘要內容

 

高電位多銅氧化酶（MCOs）是優異的氧還原反應（ORR）催化劑，但其電催化機制存在爭議：電子傳遞是通過I型銅（T1）位點還是直接轉移至三核銅簇（TNC）。本研究通過位點定向突變（M468Q MoBOD和T1D BpBOD）結合電化學測試和動力學建模，揭示T1位點是主要電子受體（圖4A-B）。TNC的高重組能（1.5 eV）阻礙直接電子傳遞，但"替代靜息態"（AR, Cl?誘導）因重組能降低（0.75 eV）可實現首輪直接電子傳遞（圖4A-B紅曲線）。Unisense氧電極證實T1突變體均相催化活性喪失，支持電化學結論。  

 

研究目的

 

闡明MCOs電催化ORR中電子傳遞路徑（T1 vs. TNC），解析TNC氧化態與重組能對電子轉移的影響，指導高效生物陰極設計。  

 

研究思路

 

1. 酶突變體設計：構建T1軸向配體突變（M468Q）和T1缺失突變體（T1D），保持TNC結構完整（圖1 EPR/UV-Vis驗證）；  

 

2. 溶液相表征：  

   ? EPR/UV-Vis分析銅位點狀態（圖1）；  

 

   ? 停流光譜測O?反應動力學（圖2-3）；  

 

 

   ? Unisense氧電極測均相催化活性；  

 

3. 電化學測試：  

   ? 碳糊電極測循環伏安（CV）和線性掃描伏安（LSV）（圖4-5）；  

 

   ? 氟/氯離子抑制效應（圖4-5）；  

 

4. 動力學建模：結合Marcus理論構建電子傳遞模型（圖6-7），擬合實驗數據。  

 

 

測量數據及其研究意義

 

1. 突變體催化活性數據  

   ? 測量內容：T1D突變體均相ORR活性完全喪失（Clark電極測O?消耗）。  

 

   ? 研究意義：證實T1位點是溶液相催化必需的電子傳遞通道。  

 

2. 電催化起始電位數據（圖4A-B, 5）  

   ? 測量內容：  

 

     ? WT起始電位800 mV vs. NHE，M468Q降至610 mV（T1電位降低）；  

 

     ? Cl?處理后二者起始電位均降至460 mV（AR態TNC直接電子傳遞）。  

 

   ? 研究意義：電位偏移揭示TNC在AR態可成為首輪電子受體。  

 

3. 計時電流數據  

   ? 測量內容：AR態酶在過電位區間（710-610 mV）無電流累積。  

 

   ? 研究意義：排除T1間接還原AR-TNC路徑，支持直接電子傳遞。  

 

4. LSV擬合參數（表3-4）  

 

 

   ? 測量內容：T1/電極耦合常數H(DA)~0.002 cm?1，TNC/電極~0.001 cm?1。  

 

   ? 研究意義：電子耦合強度相似，但TNC高重組能（1.5 eV）致其直接電子傳遞速率比T1路徑低10?倍（圖7）。  

 

結論

 

1. 電子傳遞路徑：T1是主要電子入口，因TNC高重組能（1.5 eV）阻礙直接電子傳遞（T1D突變體無催化活性）；  

2. AR態作用：Cl?誘導的AR態（重組能0.75 eV）可實現首輪直接電子傳遞至TNC（圖6B），但后續輪次仍經T1位點；  

3. 生物陰極設計：定向固定酶使TNC平均距離電極<19 ?可降低過電位>300 mV（圖8），突破T1-TNC電子傳遞瓶頸。  

 

丹麥Unisense電極測量意義

 

研究中采用Unisense Clark氧電極（實驗方法）監測溶液相酶催化O?消耗動力學，其核心價值在于：  

? 克服氣相檢測局限：直接測量溶解氧濃度（0.1 M H?SO?, pH 5.0），避免傳統頂空氣相色譜（GC）因O?溶解度變化導致的定量誤差；  

 

? 高時間分辨率：秒級監測捕捉突變體反應初期動力學，證實T1D無催化活性（對比圖2-3停流光譜的毫秒級數據）；  

 

? 驗證催化機制：通過O?消耗與電子轉移的定量關聯（TON計算），支持電化學結論——T1位點是溶液相催化必經途徑。  

 

該技術為酶催化動力學研究提供了原位、高靈敏的氧定量方案，尤其適用于低通量快速反應體系。