Self-oxygenation of engineered living tissues orchestrates osteogenic commitment of mesenchymal stem cells

工程化活組織的自氧合協調間充質干細胞的成骨承諾

來源：Biomaterials 300 (2023) 122179

 

一、摘要核心內容

本研究開發了一種基于過氧化鈣（CPO）的產氧微顆粒（OMPs），并將其整合到甲基丙烯?；髂z（GelMA）水凝膠中，用于改善缺氧微環境下人骨髓間充質干細胞（hMSCs）的成骨分化。核心發現包括：

OMPs的持續供氧能力：通過聚己內酯（PCL）包封CPO實現長效氧釋放（14天），緩解缺氧壓力。

缺氧條件下的成骨增強：OMP水凝膠在常氧（5%O?）和嚴重缺氧（<0.2%O?）環境下均顯著提升hMSCs的成骨標志物表達（ALP、OCN、OPN）和鈣沉積。

協同效應：OMPs與成骨誘導性硅酸鹽納米顆粒（SNPs）聯用（SNP/OMP水凝膠）在體內促進血管生成和宿主細胞浸潤，加速骨組織再生。

機制解析：RNA測序表明OMPs通過上調BMP6、CTNNB1等基因激活成骨通路，且缺氧環境增強其促分化效應。

二、研究目的

解決缺氧問題：克服大尺寸骨移植物因缺氧導致的細胞死亡和再生失敗。

優化材料設計：開發可控釋氧的OMPs，驗證其對hMSCs成骨分化的影響。

探索協同機制：比較OMPs、SNPs及兩者聯用對成骨分化的調控作用。

驗證臨床應用潛力：通過皮下植入模型評估材料降解、血管生成及骨形成能力。

三、研究思路

材料制備：

合成CPO-PCL微顆粒（OMPs；粒徑4.2±1.7μm，圖1A）。

構建三種GelMA水凝膠：OMP水凝膠（0.25%OMP）、SNP水凝膠（0.05%SNP）、SNP/OMP水凝膠（0.05%SNP+0.25%OMP）。

體外實驗：

力學與降解：測試水凝膠壓縮模量（45-55 kPa，圖1B）、孔隙結構（SEM，圖1C-D）及酶降解動力學（圖1E）。

氧/過氧化氫釋放：Unisense電極監測氧濃度（圖1F）和H?O?水平（圖1G）。

細胞行為：在常氧/缺氧下評估hMSCs存活、增殖（Live/Dead染色，圖2）及成骨分化（ALP活性、鈣沉積、基因表達，圖3）。

體內驗證：

大鼠皮下植入水凝膠，分析宿主細胞浸潤、血管生成（CD31+染色，圖5）及免疫反應（CD86+/CD206+巨噬細胞）。

四、測量數據及研究意義

材料表征數據（圖1）

O?釋放曲線（圖1F）：OMP水凝膠持續釋氧14天（0.31μM），而SNP/OMP組因SNP吸附O?導致釋氧量降低（<0.2μM）。

意義：揭示SNPs的氧氣吸附特性，指導復合材料設計以優化供氧。

H?O?釋放（圖1G）：OMP組H?O?濃度<30μM（低于細胞毒性閾值）。

意義：證實PCL包封有效控制CPO水解，避免氧化損傷。

細胞存活與分化（圖2-3）

 

缺氧下存活率（圖2D）：SNP組細胞存活率<50%，而OMP/SNP-OMP組>90%。

意義：OMPs通過供氧逆轉SNPs在缺氧下的細胞毒性。

ALP活性（圖3B）：缺氧下SNP/OMP組ALP活性比SNP組高3倍。

意義：OMPs與SNPs協同增強早期成骨分化。

鈣沉積（圖3I）：SNP/OMP組在缺氧下鈣沉積量顯著高于SNP組。

意義：自供氧環境促進基質礦化。

基因調控（圖4）

 

RNA測序（圖4E-F）：缺氧下OMP組上調BMP6、CTNNB1（Wnt通路）、HES1等成骨基因。

意義：闡明氧氣通過激活BMP/Wnt通路驅動成骨分化。

體內血管化（圖5）

 

 

CD31+血管密度（圖5E）：SNP/OMP組血管數量顯著高于其他組。

意義：OMPs加速移植物血管化，縮短植入體缺氧期。

五、丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

檢測目標：

溶解氧濃度：使用Unisense Opto-F1光纖氧傳感器監測水凝膠中O?釋放動力學（方法2.5.3）。

校準方法：兩點校準（空氣飽和PBS vs.氮氣脫氧PBS）確保數據可靠性。

關鍵發現與意義：

精準量化釋氧性能：

首次證實SNPs吸附氧氣（SNP/OMP組釋氧量<0.2μM），揭示材料交互作用對供氧的影響（圖1F）。

意義：為優化復合材料的氧氣控釋策略提供直接實驗證據。

支持細胞代謝需求：

 

OMP組維持0.31μM O?達14天，滿足hMSCs在缺氧下的存活與分化需求（圖2D,3B）。

意義：明確OMPs作為“人工線粒體”的功能，為臨床大尺寸移植物設計提供參數依據。

技術優勢：

高時空分辨率：實時動態監測局部氧濃度變化，克服傳統終點檢測的局限性。

意義：建立標準化評估體系，推動產氧材料在組織工程中的應用。

六、結論

材料創新：CPO-PCL微顆粒實現長效、可控供氧，H?O?釋放低于毒性閾值。

成骨增強機制：

OMPs通過上調BMP6/CTNNB1通路促進成骨分化，缺氧環境進一步放大該效應。

SNPs在缺氧下抑制細胞活性，而OMPs逆轉此效應并協同增強礦化。

臨床轉化價值：

SNP/OMP水凝膠在體內促進血管生成（CD31+↑）和宿主整合，加速骨再生。

縮短移植物預血管化周期，為臨界骨缺損修復提供新策略。