Hydrogenase-based oxidative biocatalysis without oxygen

基于氫化酶的無氧氧化生物催化

來源：Nature Communications | (2023) 14:2693

 

摘要核心內(nèi)容

 

本研究提出了一種無氧條件下基于氫化酶（SH）的NAD?再生系統(tǒng)，替代傳統(tǒng)依賴氧氣的NADH氧化酶（NOX）。關鍵突破：

 

反應機制：SH通過氧化NADH生成H?（而非H?O?），實現(xiàn)100%原子效率的NAD?再生（圖1）。

 

性能優(yōu)勢：在D-木糖→α-酮戊二酸的多酶級聯(lián)中，SH的NAD?周轉(zhuǎn)數(shù)（TTN）高達44,000 mol/mol酶，遠超NOX（圖4）。

 

 

技術突破：系統(tǒng)在開放體系中穩(wěn)定運行，H?作為唯一副產(chǎn)物可實時移除，避免O?依賴的傳質(zhì)限制（圖5-6）。

 

 

 

應用潛力：SH在攪拌反應器與放大實驗中保持高活性，為工業(yè)化無氧生物催化提供新路徑。

 

研究目的

 

開發(fā)一種不依賴O?的NAD?再生系統(tǒng)，解決傳統(tǒng)NOX的氧氣傳質(zhì)瓶頸。

驗證氫化酶（SH）在氧化NADH生成H?過程中的效率與穩(wěn)定性。

評估SH系統(tǒng)在單步及多酶級聯(lián)反應中的實際應用潛力。

 

研究思路

 

graph TD

A[酶系統(tǒng)構(gòu)建] --> B[性能優(yōu)化]

B --> C[單步反應驗證：D-木糖→D-木糖酸]

C --> D[多酶級聯(lián)驗證：D-木糖→α-酮戊二酸]

D --> E[動力學與放大實驗]

E --> F[與傳統(tǒng)NOX系統(tǒng)對比]

 

關鍵實驗設計：

酶系統(tǒng)：來自Ralstonia eutropha的氫化酶（SH）作為NADH氧化催化劑（圖1）。

優(yōu)化條件：添加FMN使SH活性提升7倍，NADH氧化活性達0.22 U/mg。

對照系統(tǒng)：FAD依賴型NADH氧化酶（NOX）作為傳統(tǒng)方法對照。

 

關鍵數(shù)據(jù)及意義

數(shù)據(jù)類別 來源圖表 研究意義

NADH氧化活性 圖1a FMN提升SH活性7倍，揭示輔因子優(yōu)化對催化效率的關鍵作用

 

單步反應性能 圖2   SH系統(tǒng)產(chǎn)物生成速率（10 μmol/h）為NOX的4倍，證明無氧系統(tǒng)高效性

 

多酶級聯(lián)TTN  圖4, 表1 SH的TTN（10,000–44,000）顯著高于NOX，驗證級聯(lián)反應適應性

 

 

H?生成動態(tài)  圖5a-b H?產(chǎn)量與產(chǎn)物形成正相關（r=0.93），證實SH催化機制為NADH→H?

放大實驗穩(wěn)定性 圖6  10 mL規(guī)模TTN>8,000，H?累積205 μmol，證明系統(tǒng)可線性放大

核心結(jié)論

 

高效NAD?再生：SH系統(tǒng)在無氧條件下實現(xiàn)TTN高達44,000，為NOX的4–10倍（表1）。

技術優(yōu)勢：

無需O?傳遞：開放體系H?自發(fā)逸散，規(guī)避NOX的O?溶解與傳質(zhì)瓶頸（圖4）。

副產(chǎn)物價值：H?可作為清潔能源或還原劑再利用（圖5）。

酶工程突破：SH在E. coli中成功表達，產(chǎn)量達1 L發(fā)酵/日（補充表4），解決工業(yè)化量產(chǎn)障礙。

應用前景：系統(tǒng)兼容好氧/厭氧環(huán)境，適用于O?敏感底物（如萜烯、多酚）的生物催化。

 

Unisense電極數(shù)據(jù)的深度解讀

技術原理

 

傳感器類型：Unisense H?微電極（NP型）

檢測原理：安培法實時監(jiān)測液相H?濃度（0–100%飽和度）

校準方法：H?飽和溶液（100%） vs. N?飽和溶液（0%）

 

關鍵發(fā)現(xiàn)與意義

 

H?生成動力學（圖5a-b）：

速率：D-木糖氧化中H?生成達1 mmol·L?1·h?1（圖5a）。

相關性：H?濃度與α-酮戊二酸產(chǎn)量線性相關（R2=0.91），證實SH催化NADH氧化→H?的化學計量關系（2H?/產(chǎn)物）。

意義：首次實時量化SH的逆向電子傳遞（NADH→H?），推翻“SH僅催化H?→NADH”的傳統(tǒng)認知。

 

系統(tǒng)開放性驗證（圖5b）：

H?擴散：攪拌后液相H?濃度驟降（>50%），證明開放體系高效移除H?（圖5b）。

意義：為反應平衡向NAD?再生方向移動提供直接證據(jù)，解釋TTN提升機制。

 

工藝優(yōu)化指導：

脈沖實驗：添加D-木糖后H?再生（圖5a），提示底物濃度調(diào)控可優(yōu)化H?產(chǎn)率。

放大設計：10 mL反應器中H?氣相累積（205 μmol）與液相監(jiān)測數(shù)據(jù)吻合（圖6），驗證Unisense數(shù)據(jù)的可靠性。

 

技術價值總結(jié)

 

機制解析：實時捕捉SH的雙向催化活性（NADH氧化/H?生成），揭示無氧NAD?再生路徑。

工藝監(jiān)控：為開放體系設計提供H?擴散動力學參數(shù)，指導反應器設計與氣體管理。

跨平臺應用：該電極適用于其他產(chǎn)H?系統(tǒng)（如電催化、光催化），推動綠色生物制造發(fā)展。

 

注：Unisense電極在本研究中的不可替代性在于其高時空分辨率與無損監(jiān)測能力，為酶促反應機理研究提供了不可替代的工具支撐。