Dynamic in situ detection in iRhizo-Chip reveals diurnal fluctuations of Bacillus subtilis in the rhizosphere

iRhizo-Chip 中的動態原位檢測揭示了根際枯草芽孢桿菌的晝夜波動

來源：PNAS 2024 Vol. 121 No. 40 e2408711121

 

1. 摘要核心內容

 

關鍵發現：

通過自主研發的微流控平臺iRhizo-Chip，首次實現了水稻根際環境中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長的原位動態監測，發現其豐度存在顯著的晝夜波動（白天增長至5,000–10,000 cells/mL，夜間降至2,000–3,000 cells/mL）。

驅動機制：

這種波動主要由根際溶解氧（DO）和pH的晝夜變化驅動（DO白天↑45%、夜間↓30%；pH白天↑5.3、夜間↓4.9），并通過體外控制實驗驗證（圖5B, C）。

技術價值：

iRhizo-Chip 兼容多種原位檢測技術（如熒光成像、平面光極），為研究根際多因子耦合過程提供了高時空分辨率工具。

 

 

2. 研究目的

 

核心問題：

解決傳統方法無法在自然土壤環境中實時監測微生物動態的局限，探究枯草芽孢桿菌在根際的時空分布規律及其與環境因子的互作機制。

應用目標：

為優化益生菌定殖策略、提升生物防治效率提供理論依據，推動可持續農業發展。

 

3. 研究思路

 

平臺開發：

設計iRhizo-Chip微流控裝置（圖1A-E），保留原位根際土壤（圖1F），集成熒光探針、平面光極（PO）等技術，實現多參數同步監測。

 

動態監測：

使用GFP標記枯草芽孢桿菌，通過流式細胞術（圖1G）和共聚焦顯微鏡（圖2C）定量其晝夜豐度變化及空間分布（圖2A-B）。

 

原位測量根際DO、pH、ROS（活性氧）、DOC（溶解性有機碳）的時空動態（圖3A）。

機制驗證：

通過線性回歸分析環境因子與菌群生長的相關性（圖3B）。

體外控制實驗驗證DO、pH、DOC、ROS對菌生長的獨立影響（圖5B-E）。

 

 

4. 測量數據及研究意義

關鍵數據來源與意義

測量指標 數據來源 研究意義

枯草芽孢桿菌豐度 流式細胞術（圖1G）

熒光成像（圖2C） 揭示菌群晝夜波動規律，證明根際微生物動態與植物生理節律同步。

DO/pH時空分布 平面光極（PO）（圖4A）

Unisense微電極（附錄圖S4） 闡明環境因子的空間異質性（根尖DO/pH變化最顯著），驗證iRhizo-Chip數據可靠性。

ROS/DOC動態 熒光探針（H?DCFDA）（圖3A）

TOC分析儀 發現ROS與DO正相關（光照期↑）、DOC與菌生長負相關（夜間↑），揭示碳代謝與氧化應激的耦合作用。

菌群空間定殖模式 共聚焦成像（圖2A-B）

附錄圖S7 顯示菌群在根尖和伸長區富集，為根分泌物驅動的趨化行為提供證據。

 

5. 核心結論

 

晝夜波動機制：

枯草芽孢桿菌的生長受根際DO和pH晝夜振蕩直接驅動（圖5A）：

DO↑（光照期）→ 促進好氧生長（圖5B）；

pH↑（5.3 vs 4.9）→ 顯著提升菌增殖速率（圖5C）。

次要因素作用：

DOC↑促進生長但根際夜間DOC積累與菌豐度負相關（圖3B, 5D），暗示碳源競爭或代謝抑制；

高濃度ROS抑制生長（圖5E），但生理范圍內的ROS波動與菌豐度正相關。

技術突破：

iRhizo-Chip 首次實現自然根際土壤環境下的多參數原位聯測，為研究微生物-植物-環境互作提供了范式工具。

 

6. 丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

數據來源與方法

 

測量目標：

使用Unisense OXY25（DO）和pH-N微電極（丹麥Unisense公司），在自然土壤中每30分鐘監測根際DO/pH動態（附錄圖S4），與iRhizo-Chip內PO數據對比。

對照設計：

將芯片內PO數據（圖3A, 4A）與Unisense微電極的自然土壤數據同步分析，驗證芯片模擬環境的真實性。

 

研究意義

 

驗證平臺可靠性：

Unisense電極作為土壤原位檢測金標準，其數據與iRhizo-Chip的PO結果高度一致（附錄圖S4），證明iRhizo-Chip能準確模擬自然根際的DO/pH晝夜波動（如DO光照期↑15%），消除了微流控體系"脫離真實環境"的質疑。

揭示生態關聯性：

Unisense數據證實自然根際存在強氧化-還原梯度（根尖DO最高，徑向遞減），與iRhizo-Chip中菌群的空間分布吻合（圖4B）；

二者協同證明：植物光合節律（光照→根系釋氧→DO↑/pH↑）是驅動微生物晝夜動態的核心生態鏈路。

技術互補性：

微電極提供點尺度高精度數據，而iRhizo-Chip實現二維時空成像，二者結合為根際多尺度過程研究提供完整方案。

 

總結

 

該研究通過創新性平臺iRhizo-Chip，首次揭示了枯草芽孢桿菌在根際的晝夜生長波動受DO/pH直接調控，并利用Unisense微電極驗證了人工芯片與自然土壤環境的一致性。這一發現深化了對根際微生態時間動態的理解，為設計"時間精準"的微生物接種策略（如白天施用益生菌）提供了理論支撐，同時推動了原位檢測技術在土壤生態學中的應用邊界。