Hydrogen production by a fully de novo enzyme （微生物產氫）通過完全從頭酶制氫

來源：Dalton Trans., 2024, 53, 12905–12916

 

1. 論文摘要核心內容

 

研究對象：基于全新設計的三α螺旋蛋白（a3C）和鈷基催化劑（鈷肟，cobaloxime）構建的人工酶。

核心發現：該人工酶在中性水溶液中通過電化學、光化學和化學還原三種途徑高效催化產氫（HER）。

創新點：首次證明小分子從頭合成蛋白（de novo protein）可作為酶支架，用于開發生物啟發的可持續產氫系統。

性能：產氫轉化數（TON）達游離鈷肟的80%，但速率為其40%，表明蛋白環境對催化動力學有調控作用。

 

2. 研究目的

 

解決關鍵挑戰：傳統鈷肟催化劑需有機溶劑且水相穩定性差，限制其實際應用。

核心目標：設計水溶性、基于豐產元素（Co）的人工氫酶，實現中性水中高效產氫。

科學意義：探索人工蛋白支架在優化催化劑性能（穩定性、效率）中的作用。

 

3. 研究思路

 

分子設計：

通過非天然氨基酸（3-甲基吡啶-半胱氨酸）將鈷肟共價錨定于a3C蛋白的32位點（圖1）。

 

結構表征：

驗證鈷肟結合（質譜、UV-Vis）、蛋白折疊（圓二色譜）、鈷價態（EPR）及電化學行為（循環伏安）。

功能測試：

在電化學、光化學（[Ru(bpy)?]2?/抗壞血酸體系）和化學還原（[Eu(EGTA)]2?）條件下量化產氫性能。

機制分析：

對比游離鈷肟與人工酶的活性差異，探討蛋白微環境對催化動力學的影響。

 

4. 關鍵數據及研究意義

（1）結構表征數據

 

圖2A（MALDI-ToF-MS）：

質譜峰證實鈷肟成功連接至蛋白（m/z 7550.5 → 鈷肟-蛋白復合物）。

意義：驗證人工酶合成路徑可行性。

 

圖2B（圓二色譜）：

鈷肟結合后α-螺旋含量降至50%（游離a3C為78%），但整體穩定性不變（ΔG~-4.3 kcal/mol）。

意義：蛋白結構可容忍金屬催化劑嵌入，維持基本折疊。

圖2C（EPR）：

Co(II)信號（g≈2.3）證實還原態鈷中心存在，譜線差異表明蛋白環境限制溶劑配位。

意義：蛋白微環境調控鈷的配位結構。

圖2D（循環伏安）：

人工酶（3）與游離鈷肟（2）還原電位相近（-0.90 V vs. NHE），但催化電流形狀不同。

意義：蛋白支架保留電催化活性，但影響電子傳遞路徑。

 

（2）產氫性能數據

 

光化學產氫（圖3B-C & 表1）：

圖3B（Unisense實時監測）：pH 6.2時，人工酶（3）TON=49（游離鈷肟TON=62）。

圖3C（GC終點檢測）：pH 6時人工酶產氫量（41 μM H?/μM催化劑）略高于游離鈷肟（33 μM）。

表1（動力學參數）：pH 7時人工酶速率（2.5 μmol H?/min/μmol cat）為游離催化劑的40%。

 

 

化學還原產氫（圖4 & 表1）：

圖4A-B：[Eu(EGTA)]2?還原下，人工酶初始速率顯著低于游離鈷肟（pH 7: 6.0 vs 2.5 μmol/min/μmol cat）。

意義：蛋白環境減緩電子/質子傳遞，但提升pH適應性（pH 6活性反超）。

 

 

5. 核心結論

 

成功構建人工氫酶：首次將鈷肟整合至從頭設計蛋白支架，實現中性水中多途徑產氫。

蛋白支架的雙重作用：

優勢：提升催化劑水溶性及pH穩定性（pH 5-8保持活性），保護活性中心。

局限：空間位阻降低傳質速率，導致產氫速率下降至游離催化劑的40%。

應用潛力：小分子從頭合成蛋白（高效原子經濟性）可作為可擴展生物啟發催化劑的理想支架。

 

6. Unisense電極數據的詳細解讀與研究意義

數據來源

 

圖3B：光催化產氫的實時動力學曲線（Unisense H?微傳感器監測）。

圖4A-D：化學還原產氫的實時動力學曲線（同前）。

表1：基于Unisense數據的產氫速率（μmol H?/min/μmol cat）和TON。

 

研究意義

 

高時空分辨率動力學解析：

Unisense電極實現秒級實時監測溶解H?濃度，捕捉傳統GC無法獲得的初始速率信息（圖4A-B斜率）。

例：光催化中人工酶（3）的產氫滯后現象（圖3B），揭示蛋白環境導致電子傳遞延遲。

 

揭示pH依賴性的動態機制：

實時數據（表1）結合GC終點（圖3C）發現：

pH 6時人工酶活性反超游離催化劑 → 蛋白微環境優化局部質子傳遞。

pH >7時速率下降 → 游離鈷肟受限于Co-H形成能壘，而人工酶受蛋白剛性限制。

 

量化傳質限制效應：

化學還原中（[Eu(EGTA)]2?過量），人工酶速率僅為游離催化劑40%（圖4），直接證明：

蛋白口袋的位阻效應是速率限制主因（非電子轉移能力）。

光催化中因還原劑濃度低，速率差異被掩蓋（表1）。

 

指導后續設計：

數據表明：需在蛋白口袋引入質子中繼基團（如Glu/Lys）或柔性結構域以平衡保護性與傳質效率。

 

技術優勢

 

無損原位監測：避免GC的取樣誤差，尤其適用于短壽命中間體研究。

高靈敏度：檢測限達μM級H?，精準量化低濃度催化活性。

 

總結

 

該研究通過整合結構生物學、電化學與實時傳感技術，證實從頭設計蛋白支架在可持續催化中的潛力。Unisense電極提供的動態動力學數是揭示蛋白微環境對傳質影響的關鍵，為下一代人工酶設計提供了實驗與理論基石。